胡萝卜愈伤组织的诱导与继代培养实验报告.doc

Y UNNAN NORMAL UNIVERSIT Y 本科学生综合性实验报告 学号 姓名 学院—生命科学学院 专业、班级 实验小组及成员 实验课程名称 教师及职称 开课学期 2011 至 2012 学年 下 学期 填报时间 隹 6 月］ 日 云南师范大学教务处编印 一.实验设计方案 实验序号 二 实验名称胡萝卜愈伤组织的诱导和增殖培养 实验吋间 2012.04.05—2012.05.24 实验室 实验室 325 实验内容： 1胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制 2胡萝卜愈伤组织的诱导 3胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制 4胡萝卜愈伤组织的继代培养 1.实验冃的 1） 通过本次实验，进一步熟悉配制培养基的流程及操作屮应注意的事项，学会设 计和筛选胡萝卜愈伤组织诱导培养基配方。 2） 通过本次实验，能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。 3） 通过本次实验，能够熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进-?步熟悉、 规范无菌操作技术。 2.实验原理、实验流程或装置示意图 实验原理 1） 将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基屮规定的使用浓 度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合姜求的培养基。 2） 将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块接种于愈伤组织诱导培 养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。 3） 对愈伤组织进行继代培养可以得到更多的愈伤组织。 实验流程 配置胡萝卜愈伤组织诱导培养基 一?接种胡萝卜肉质根诱导愈伤组织产生 一? 配置胡萝卜愈伤组织增殖培养基——?接种胡萝卜愈伤组织进行增殖—— 验 结果观察记录 3.实验设备及材料 1） 实验用具和仪器 冰箱、普通天平、三角瓶、果酱瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用 口杯、精密pH试纸（pH5.4?7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、棉 线、电炉、高丿衣蒸汽灭菌锅、电磁炉等。酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状 银子、手术剪、解剖刀、己灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、恒温培养箱、100ml 三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管等。 2） 药品和试剂: MS培养基母液、常用试剂母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸镭水、lmol?L?lHCl、 ImolLlNaOH、胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75%酒精、0.1%HgC12,、 愈伤组织继代培养基、蒸惚水等。 3） 材料：胡萝卜肉质直根、处于脱分化进程屮的胡萝卜愈伤组织 实验方法步骤及注意事项 实验步骤： （1） 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配方及配制体积 A、培养基配方设计： a根据培养的n的选择一种培养基为基本培养基。 b确定培养基屮各种激素的浓度及相对比例 B配方： MS 基本培养基 + 1 mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.7%琼脂+3%蔗糖 C配制体积： 每小组配制0.5L,每人用50ml三角瓶分装5瓶，每瓶约装25ml培养基。 （2） 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制步骤 一药品及用具的准备 培养基配制 根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（3.5g）,放入医用口杯屮，加入适量 的蒸馆水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用 玻棒搅动。 MS基本培养基配置：（配置前先检查各母液情况，如发现有霉菌和沉淀结晶产生, 就不能再使用）。大量元素母液:25ml；微量元素母液：2.5ml；铁盐母液：2.5ml； 有机物母液：各 2.5ml。0.5mg/L2,4-D 取 lml, 0.5mg/L6-BA 取 2.5ml。混匀。 待琼脂完全溶解后，加入规定用量的蔗糖（15g）,继续加温并不断搅拌，待琼脂 煮透后端离火源，再加入所需用量的母液（可事先取好放于一烧杯屮），最后加蒸 镭水至所需体积，即500mlo 调节培养基的酸碱性至pH5.8 培养基配制好后应立即进行pH值的调整。用精密pH试纸测试。培养基若偏酸时用 lmol ? L-l NaOH来调节,偏碱则可用lmol ? L-l HC1来调节。 培养基的分装 配制好的培养基要趁热分装，培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用棉线扎紧。 本次实验中500ml分装到20个三角瓶，每人5瓶。 培养基的灭菌 培养基分装后应立即置于高床蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约 为 1.06kgf -cm-2 或 0.105 MPa （可在（）.105 ?0.12MPa 间，但不得超过 0.14 MPa）, 温度12KC时保持15?30 min左右即可。 尢菌蒸憾水和接种工具准备 用果酱瓶装自来水，用不透气的封口膜封口灭菌后即为无菌水。接种工具也是用纸 包好灭菌。 （3）接种前准备工作 A外植体表面灭菌前的准备工作 a接种室的