胡萝卜愈伤组织的诱导培养.doc

YUNNAN NORMAL UNIVERSIT Y 学号 姓名 学院 牛命科学学院 专业、班级09级牛?物科学B班 实验课程名称 教师及职称 开课学期 2011 至 2012 学年下 学期 填报时间 2012 年 6 月 1 日 一.实验设计方案 实验序号 二 实验名称 胡萝卜愈伤组织的诱导培养 实验时间 2012.2- ——2012.6 实验室 327 1 ?实验内容： 1、 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制 2、 胡萝卜愈伤组织的诱导 3、 胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制 4、 胡萝卜愈伤纽织的继代培养 2?实验目的 1） 通过本次实验，能熟练准确配制MS培养基母液和纽培室常用的化学试剂。 2） 通过本次实验，使学生能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 3） 通过本实验，使同学们能够熟练的掌握外植体的农面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计 和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。 4） 通过本次实验，使同学们熟练掌握愈伤纽?织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无 菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 厂女验原理「^验流程或装置京 1） 、培养基的成分 目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物纽织培养中所用的培养基都是山无机营养物、 碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。 2） 、培养基的配制方法 I、 配制培养基的最简丫L的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸懈水里，加上蔗糖、琼脂和其 他必要的补加物，再加入蒸谓水使之达到最终的容积。最后调节PH值，高压灭菌，于是制成所 需要的培养基。 II、 如果没有培养基干粉，则町采用以下两种方法來配制： 一个是按照配方规定的数量分别称量出齐种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们 混合在一起。 另一?个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在2?4°C冰箱内，待配培养基时収出, 按比例稀释配用。此法较为常用。 3）、MS培养基母液的配制 在配制MS培养基母液时，为减少工作最可以把几种药殆（如培养基屮的大量元素或微量） 配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。 通常把每种试剂甲独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶 解后再加入后一种化合物。混合己溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与 SO42-和PO43■错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物；同时，耍慢慢地混合，边混合边搅 拌。 母液的配制有两种方法： i--种是恥制成用一化合物母液。此法适合配制多种培养基都需要的同一-种母液。 ii另一种是配成几种不同化合物的混合母液。此法在大最配制同种培养基时省力。 配好的母液应放在试剂瓶中贮存。 4.实验方法步骤及注意事项 实验步骤： ⑴胡萝卜愈伤纽织诱导培养基的配方及配制体积 A、培养基配方设计： a根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。 b确定培养基中各种激素的浓度及和对比例 B配方： MS 基本培养基十 lmg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.7%琼脂+3%蔗糖 C配制体积： 每小组配制0.5L,每人用100ml三角瓶分装5瓶,每瓶约装25ml培养基。 （2）胡萝卜愈伤纽织诱导培养基的配制步骤 关紫外灯，并保持风机吹风状态；将 关紫外灯，并保持风机吹风状态；将 A. 药殆及用具的准备 B. 培养基配制 C. 调节培养基的酸碱性至pH5.8 D. 培养基的分装 E. 培养基的灭菌 F. 无菌蒸馅水和接种工具准备 (3) 接种前准备工作 各组的培养基，无菌水、解剖刀、银子等操作工具放到超净台上，并进行消毒待用。 b消毒溶液、无菌水、装材料的容器、解剖刀、蹑子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。 c配置消毒溶液: 1.5g HgCl2+1000ml蒸馅水,配置成0.15%的HgCj（1000毫升的2份） B实验材料的准备 a准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料； b实验材料的修整、刷洗、冲洗; c用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自來水冲净。 每纟111?2根胡萝卜，用试管刷和肥皂洗净，进行初次表而清洁；洗净后用干净的烧杯盛放, 用小刀切成合适大小的4段（每人1段），转入超净台待用。 （4 ）植物材料的农面灭菌和接种 操作人员洗手消毒 装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒 将待消毒的材料浸入75%的酒精中10秒，収出转入无菌水冲洗干净。（酒精单独一个杯子装, 消毒完毕转下一组使用） 将无菌水倒出，并倒入消毒剂（0.15 %HgC12 ）并计时20分蚀；（同一瓶子中操作即可，但 注意不要碰到瓶口等关键部位） 到预定时间（20分钟）后，倒出消毒液，并用无菌水淸洗4遍，保证消毒液全部淸洁干净。 将洗净的材料用灭过菌的银子夹出，放到干净的滤纸上吸干水分，并在滤