反向遗传学及其相关技术.ppt

2021/3/14 * miRNA及其作用机制 miRNA(microRNA) : 微小RNA,指长度约21～25nt的小分子单链RNA,位于基因组的非编码区,进化上高度保守,可在翻译水平上对基因表达进行调节的RNA家族。其介导的沉默机制也属于转录后的基因沉默。 miRNA基因的表达具有特定模式: 阶段特异性和组织特异性,在不同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA 表达。 2021/3/14 * miRNA的作用机制 2021/3/14 * 相同点: 长度都约22 nt 左右; 同是Dicer产物,因此具有Dicer产物的特点; 二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在; 同是RISC的组分。 miRNA与siRNA比较 2021/3/14 * 来源不同:siRNA来源于转基因或病毒RNA,由长dsRNA转变而来;miRNA来源于内源转录本,是细胞内RNA的固有组分之一,由具有发夹状结构的pre-miRNA转变而来; 结构不同:siRNA主要以双链形式存在,其3’端存在2个非配对的碱基,通常为UU;miRNA主要以单链形式存在; 对靶RNA 的特异性不同: siRNA与靶mRNA完全互补配对结合;miRNA与靶RNA并不完全互补,存在错配现象。靶序列有一个核苷酸突变,就会影响到siRNA的作用功能,但不会影响到miRNA的功能; 作用形式不同:siRNA主要在转录后通过降解mRNA发挥作用,而miRNA只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。 不同点: 2021/3/14 * （四）、RNA干扰的研究方法 一般技术路线 2021/3/14 * （五）、RNA干扰的应用 1.基因功能研究 由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应。 与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势,近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多,标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 2021/3/14 * 2.病毒性疾病的治疗 使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。某研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA,激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5（化介素受体, HIV-1的辅因子）进入人体外周Ｔ淋巴细胞,而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4,从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答,由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。 ——艾滋病 2021/3/14 * 2.病毒性疾病的治疗 Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体:pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X-siRNA或 core-siRNA转染后,core蛋白水平分别降低了89%、63%,转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%,但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物,而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。 —— HBV（乙肝病毒） 2021/3/14 * 2.病毒性疾病的治疗 Randall等证明了针对HCV RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍;将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞,siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用;siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。 —— HCV（丙肝病毒） 2021/3/14 * 2.病毒性疾病的治疗 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等,siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫,用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。 严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的防治研究,RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制,病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断,这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。 ——脊髓灰质炎病毒/SARS 2021/3/14 * 3.