叶绿体的分离教学资料.pdf

1.3 叶绿体的分离 1.3.1 植物组织匀浆 1．去掉水稻叶片中脉，把叶片剪成 3-5mm 小段。 2 ．取 10g 剪碎的叶片，在研钵中加入液氮，将叶片研磨成精细的粉末；加 入预冷的提取缓冲液（ 200 mL/10 鲜重），继续研磨成匀浆（注：对于菠菜等纤 维素含量低的植物叶片，使用匀浆机匀浆叶片组织即可。如果组织匀浆太剧烈， 叶绿体中的淀粉结晶会导致叶绿体破碎）。 3．在不挤压纱布的情况下， 用四层纱布过滤匀浆物， 使匀浆液自然流下 （如 果挤压纱布过滤，叶绿体得率会提高）。 1.3.2 叶绿体的分离 1.3.2.1 蔗糖梯度制作 用提取缓冲液按表 1 要求，配制不同浓度的蔗糖溶液 （长时间不用，应存放 在-20℃冷冻保存，以防长菌）。取一只 30 mL 的离心管，从下到上铺加 4 、6、 4mL 的 60%，40%，20%蔗糖混合物，置于 4℃冷藏备用。 表 1 不同浓度的蔗糖溶液（ w/v ） 蔗糖溶液 60% 40% 20% 蔗糖（ g ） 60 40 20 终体积（ mL ） 100 100 100 1.3.2.2 叶绿体的分离 1． 将匀浆液分装在已灭菌的 30 mL 离心管中，在 SIGMA 4K15C 离心机 （Nr.11150 转子） 离心 2 分钟 （500×g, 4℃），去掉细胞核和细胞碎片等沉淀物。 2 ．将上清液离心 10 分钟（ 2500 ×g, 4℃），倾出上清液，保留沉淀。 3．向沉淀中加入大约 4 mL 提取缓冲液，用画刷温和重悬沉淀。 4 ．将重悬液铺加在 60%/40%/20%不连续蔗糖梯度上， 2000 ×g 离心 10 分 钟（ 4 ℃）。 5．用巴斯德吸管吸取中部 40%蔗糖层的绿色条带溶液 （上部20%蔗糖层的绿 色条带为破碎的叶绿体， 下部 60%蔗糖层含有灰白色细胞核和细胞碎片等沉淀） ， 把它转移到一干净的 30 mL 离心管中。 6 ． 在叶绿体的悬浮液中加入 5 倍体积的洗涤缓冲液， 2500 ×g 离心 10 分 钟（ 4 ℃），回收叶绿体。 7．倾去上清液， 加入 20 mL 洗涤缓冲液， 用画刷温和重悬沉淀， 2500 ×g 离 心 10 分钟（ 4℃）；重复操作 1-2 次（须除去所有的蔗糖）。 8． 用 3 mL 左右的洗涤缓冲液温和重悬沉淀。 9． 用相差显微镜检测叶绿体是否完整 （完整的叶绿体在显微镜下很亮， 而 不是在视野中发暗或半透明）。