紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用.docx

文档收集于互联网，已重新整理排版 文档收集于互联网，已重新整理排版.word版本可编辑，有帮助欢迎下载支持. 1 1文档来源为:从网络收集整理word版本可编辑. 紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用 作者：郭春龙黄艳丽朱晓敏张春阳冯禄王赞滔姜华茂 【关键词】紫杉 摘要：目的：探讨紫杉醇体外抑制膀胱癌EJ细胞株及诱导凋 亡的作用。方法：体外培养膀胱癌EJ细胞株，以不同浓度紫杉醇处理 12?72h后，通过MTT法测定细胞生长抑制作用，釆用电镜观察和DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：紫杉醇能抑制EJ细胞的生长, 并在一定剂量和时间范圉内呈现岀明显的时间、浓度依赖关系。电镜 下凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成花瓣形。 电泳见出现典型的凋亡DXA梯形带。结论：紫杉醇能抑制膀胱癌EJ 细胞株的生长，诱导凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一。 关键词：紫杉醇；膀胱癌；细胞凋亡 膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，手术切除是膀胱癌治疗 的首选方法。但是膀胱癌的易复发性常使单纯采用手术疗法难以获得 满意疗效，应用化疗作为辅助治疗手段可望减少肿瘤患者的复发率, 提高其生存率。紫杉醇（Paclitaxel,商品名：Taxol）是从紫杉树皮 中提取的一种新型抗微管广谱抗癌药，具有特异性地稳定细胞微管的 作用［1］。本研究旨在体外观察紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株的抑制和诱 导凋亡作用，以探讨紫杉醇对膀胱癌的临床应用价值。 1材料与方法 11试剂 紫杉醇市上海华联制药有限公司提供，临用前稀释至所需浓 度；RPMI1640培养基（含10%胎牛血清，青霉素及链霉素各lOOU/ml）； L谷氨酰胺2mmol/L.丙酮酸钠Immol/L购自华美公司；四甲基偶氮 蓝（MTT）购自Sigma公司。 12细胞培养 人膀胱癌EJ细胞株购自上海午立生物有限公司，培养于含有 10%胎牛血清，100 U/ml青霉素、链霉素的培养基中，在37°C、5% C02 培养箱内常规传代培养。取对数生长期细胞用于实验。 13实验分组 对照组：不加药，每天更换1640全培养液。实验组：紫杉醇 浓度分别为10、50、100、500nmol/L,接种细胞24h进入对数生长期 后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。 14细胞毒性分析 应用MTT比色法测定不同浓度紫杉醇对EJ细胞增殖的影响, 并绘制剂暈:效应曲线。将对数生长期的EJ细胞以0.25%胰蛋口酶消 化，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，细胞数 为2X 104/ml接种于96孔培养板。接种细胞24h进入对数生长期后开 始加入不同终浓度的紫杉醇，每浓度设4个复孔，并设对照孔。置于 37C含5% C02孵箱中分别培养12.24、48、72h后每孔加MTT（5ing/ml） 20111。作用4h后弃上清，各孔加入100 U 1 DMSO,振荡lOmin,使结 晶物充分溶解。在酶标仪570nni波长处读取吸光度A值。细胞生长的 抑制率（％ ）=（对照组A值一实验组A值）/对照组A值X100%[2]。 15透射电子显微镜观察 取对照组及实验组细胞（细胞数暈为106?107）倒岀瓶中培 养液，用 PBS 液(O.Olmol/L, PH7. 2)洗 3minX3 次，后加入 2.5% 戊二醛4C放置lOmino用接种环刮下细胞移入离心管中，2000r/min 离心15mino用接种环刮起细胞块，将细胞块与戊二醛一起转移到青 霉素小瓶中，4°C放置2h。用PBS洗3minX3次（注意加液时一定不 要冲散细胞团块），1%锹酸在4C固定Ih。PBS洗3minX3次，脱水 （50%、70%、80%、90%、100%乙醇各 1 次 15min/次；100%丙酮 2次，lOmin/次）。吸弃瓶中的脱水剂，加3nil纯丙酮EP0N812包埋剂 （1： 1体积比），室温下放置30min后，弃去稀释的包埋剂，加纯包 埋剂Iml室温放置2h或过夜。吸混合包埋剂2滴于2号胶囊模块孔的 底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注意混合包埋剂，置37°C\ 45°C 分别12h,置60°C 24h,修块，制备半薄切片，定位后制备超薄切片, 醋酸铅铀染色，透射电镜观察。 16 D\A提取及电泳分析 取对数生长期的EJ单细胞悬液2X106个接种于培养瓶内, 24h后待细胞进入对数生长期开始加入不同浓度的紫杉醇，培养48h 收集贴壁及悬浮细胞,lOOOr/rain,离心5min,弃培养液,再加入IralPBS 重悬细胞移入1ml微量离心管中，lOOOr/mirit离心5min弃上清。加 入50卩1细胞裂解液，混匀，于37C水浴至混合物变得清亮。在高速 冷冻离心机中一4°C 12000/niint lOmin,将上清转移至另一微量离心 管