细胞和细胞器及间质的分离.docx

文档收集于互联网，已重新整理排版 文档收集于互联网，已重新整理排版word版本可编辑，有帮助欢迎下载支持. 1 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑. 第一篇组成人体的细胞 第三章 亚细胞结构的分离与鉴定 细胞山各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组 分，观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一日标的基本手段。一 般认为，转速为10?25Kr/mm的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min,离 心力大于89Kg者称为超速离心机。U前超速离心机的最高转速可达lOOKr/min, 离心力超过500Kg。 第一节亚细胞结构分离的技术 分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆 (Homogenization)是在低温条件下，将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆 介质(即0?25moLZL蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液)研磨，使细胞被机械地研碎 成为各种亚细胞组分和包含物的混合物。 分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过山低速到高速离心技术，使非 均一混合体中的颗粒按其大小轻《分批沉降到离心管的不同部位，再分部收集, 即可得到各种亚细胞组分。山于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时 是均匀分布于整个离心管中，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最巫的 颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心 和密度梯度离心。 差速离心(differential centrifugation)是在密度均一的介质中山低速到高速 逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺 序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后 为核糖体。山于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，一般重复2?3次效果会好 一些。通过差速离心可将细胞器初步分离，但常需进一步通过密度梯离心再行分 离纯化。 密度梯度离心(density gradient centrifugation)是用一定的介质在离心管内 形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过? 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离乂可分为速度沉降和等密度沉 降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化锂，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介 质要求：能产生密度梯度，且密度高时，粘度不商；pH中性或易调为中性；浓 度大时渗透圧不大；对细胞无毒。①速度沉降(velocity sedimentation)主要用于 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介 质的最大密度应小于彼分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十 分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离：②等 密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器 在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度 相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的 最大密度。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10、100倍，故往往 需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不 利。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 分离亚细胞组分的第三步是对分级分离得到的组分进行分析，以确认。常要 的分析方法包括形态和功能鉴定。 第二节细胞核与线粒体的分级分离 一、所需试剂及设备 小白鼠、冰块、玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平.光 学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25mI 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、银子、吸水纸、纱布、蜡盘、平皿、牙签。0.25moL/L 蔗糖一0.003molZL CaCb溶液、1%屮苯胺兰染液、0.02%詹纳斯绿B染液、 0?9%NaCl溶液。 附:溶液的配制: 1/3001纳斯绿染液: 取詹纳斯绿1克，力口Riger氏液300ml。现用现配。 1/3000中性红染液: 称取中性红(Neulnil red)O?lg,加蒸憎水300ml。室温保存. Ringer Solution： NaCl KC1 0?042g CaCb O?O25g 蒸懈水 100m I 0.25inoi/L 蔗糖一0.003inoin/L 氯化钙溶液: 蔗糖 85?5g CaCh O?33g 蒸懈水 1000ml 二、操作步骤 （-）制备肝细胞匀浆 将小0鼠用颈椎脱位法处死，迅速开腹取肝，剪成小块（去除结缔组织）尽快 置于盛有0. 9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 称取Ig肝组织（湿重）