单克隆抗体制备流程图[实用].docxVIP

20XX 流程汇编 Process compilation 单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行交融，构成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，然后创立了单克隆抗体杂交瘤技能。这一技能上的打破不仅为医学与生物学根底研究创始了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治供给了新的东西。 　　制备单克隆抗体包含动物免疫、细胞交融、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的许多生产，要通过几个月的一系列试验进程，下面依照制备单克隆抗体的流程次序，逐个介绍其试验办法。 一、细胞交融前预备 　　(一)　免疫计划 　　选择适宜的免疫计划关于细胞交融杂交的成功，取得高质量的McAb至关重要。一般要在交融前两个月左右树立免疫计划开端初度免疫，免疫计划应依据抗原的特性不同而定。 　　1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可取得很好的免疫作用。下面以细胞性抗原为例的免疫计划: 　　　　　　　　　　初度免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip (腹腔内打针) 　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后 　　　　　　　　　　第2次免疫　　　　　1×10７／0.5ml ip 　　　　　　　　　　　　↓　3周后 　　　　　　加强免疫(交融前三天)　1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内打针) 　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　取脾交融 　　2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏彻底佐剂，福氏不彻底佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易立刻分散呈小滴状标明已到达油包水的情况。商品化福氏彻底佐剂在运用前须振摇，使沉积的分枝杆菌充沛混匀。 　　　　　　初度免疫　 Ag　1～50μg　加福氏彻底佐剂皮下多点打针 　　　　　　　　│　　(一般0.8～1ml　0.2ml／点) 　　　　　　　　↓3周后 　　　　　　第2次免疫　剂量同上，加福氏不彻底佐剂皮下或ip 　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超越0.5ml) 　　　　　　　　↓3周后 　　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip 　　　　　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫作用) 　　　　　　　　↓2～3周后 　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv 　　　　　　　　↓3天后 　　　　　　　取脾交融 　　现在，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫计划也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可下降抗原的运用量。②改动抗原注入的途径，根底免疫可直接选用脾内打针。③运用细胞因子作为佐剂，前进机体的免疫应对水平，促进免疫细胞对抗原反响性。 (二)　养殖细胞 　　在制备单克隆抗体进程中，许多环节需求加养殖细胞，如：在杂交瘤细胞选择、克隆化和扩展培育进程中，参加养殖细胞是十分必要的。常用的养殖细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照耀后作为养殖细胞，运用比较便利，照耀后可放入液氮罐长时刻保存，随用随复苏。 　　　　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备 　　　　　小鼠选用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 　　　　　　↓ 　　　　　拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 　　　　　　↓ 　　　　　用无菌剪刀剪开皮肤，露出腹膜 　　　　　　↓ 　　　　　用无菌打针器注入6～8ml培育液 　　　　　　↓ 　　　　　重复冲刷，吸出冲刷液 　　　　　　↓ 　　　　　放入10ml离心管，1200转／别离心5～6分钟 　　　　　　↓ 　　　　　用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培育液混悬，调整细胞数1×10５／ml 　　　　　　↓ 　　　　　参加96孔板，100μl／孔 　　　　　　↓ 　　　　　放入37℃　CO2孵箱培育 　　一般养殖细胞在交融前一天制备，一只小鼠可取得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为养殖细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。 (三)　骨髓瘤细胞 　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物归于同一品系，这样杂交交融率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生许多　McAb。 　　常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。 　　骨髓瘤细胞的培育适合于一般的培育液，如RPMI1640，DMEM培育基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩展培育以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时刻为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞