遗传工程动物模型.pptx

;概述;定 义; 技术手段;发展历史 ;到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。 从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。;遗传工程动物遗传修饰的策略;;导致功能丢失的基因组修饰（Loss of Function）;基因打靶 gene targeting; 基因打靶是利用DNA同源重组原理，基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（gene knockout）和基因敲入（gene knockin）。 基因敲除： 传统基因敲除（conventional knockout） 条件性基因敲除（conditional knockout） ;基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的,是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。 同源重组（Homologous Recombination)是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。;Creation of “Knock-out” or “Knock-In”Mice;Knock-in Mice;条件性敲除小鼠;导致功能丢失的基因组修饰（Loss of Function）;Cre 为38kDa 的蛋白，其识别位点loxP为34bp;Conditional knock out (CKO)(Tissue- or cell type-specific);CreER-Loxp system;条件性基因敲除优点：1. 诱导基因突变的时间可人为控制；2. 可避免因基因突变而致死胎的问题；3.如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达。;几种常用的工具鼠;Rosa26-DTR; Rosa26-DTA;打靶载体的构建 打靶载体导入ES细胞：重组置换 基因敲除ES细胞注射入囊胚 囊胚植入假孕小鼠的子宫中 嵌合体的杂交育种 ;基因敲除的基本程序;Homologous recombination;neor ：新霉素抗性基因，neor基因存在于打靶体内，当重组（同源或随机整合）后，ES细胞能在含新霉素G418的培养液中生长 positive selection HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，该基因产物可分解单核苷酸类似物(ganciclovir)生成毒性产物，产生自杀效果 同源重组时：Tk-基因丢失，ES细胞存活 随机整合时：Tk-基因存在，ES细胞死亡 negative selection ;2、将载体导入ES细胞;Recombinants with random insertion-containing both neo and tk;4 、将基因敲除ES细胞注射入囊胚，形成嵌合胚胎，得??嵌合体小鼠，而后筛选培育阳性子代小鼠。 ;适合提供宿主囊胚的供体小鼠的挑选;超排过的供体 ;受体鼠 (Receptions）: 接受操作胚胎的假孕母鼠 ? 年龄: 6-20周龄 ? 品系: 任何品系母性良好的母鼠 e.g., KM，CD1 ;假孕 (Pseudopregnancy）: 发情期的母鼠在与无精子的公鼠交配后的一定时间内，黄体素会持续存在，而使它自己的行为和身体处于适合胚胎种植，及养育子鼠的状态。 ;结扎公鼠 (Vasectomized male mice）: 输精管结扎过的公鼠。具有正常的交配能力，由于输精管中没有精子，与母鼠交配后，可使母鼠处于假孕状态。 ;结扎公鼠的方法;阴栓 (Vaginal plug ）： 小鼠交配后，精液在凝固腺的作用下，会凝固形成栓塞，堵塞在阴道口与子宫口之间。它可以做为母鼠成功交配过的依据。 ;囊胚显微注射流程图;囊胚收集;囊胚发育的各阶段;囊胚子宫移植;host;生殖系传递 (Germ line transmission）: 即所得到的嵌合体小鼠中具有参与生殖系传递能力的es细胞;;自敲除小鼠基因的方法诞生那天起，生命科学家就思量着为大鼠敲除基因，却在漫漫28年中无所突破——主要原因在于，人类对胚胎干细胞的认识还太浅，小鼠的胚胎干细胞提取和培养方法，无法套用到大鼠、兔、猪、猴的身上。;TALEN技术制作基因敲除鼠;TALEN技术流程图;TALEN技术特点 1、可以应用于大小鼠；无动物品系限制，永久失活； 2、成功率可达20-50%以上； 3、实验周期短、价格低 。;CRISPR/Cas9基因敲除鼠; CRISPR/Cas9技术特点 1、可实现对靶基因多个位点或多个基因同时敲除； 2、实验周期短，价格低； 3、可应用于大、小鼠等，无物种限制。 ;基因组随机