生物化学知识点一核酸的复性核酸的提取、分离与鉴定.ppt

第六节 核酸的提取、分离与鉴定 一、核酸的提取与分离 破碎细胞→提取核蛋白→分离核酸与蛋白质→纯化核酸。具体参考方法： 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。可用三氯醋酸沉淀出核蛋白，并用95%乙醇加热除去附着在沉淀上的脂类杂质。然后用10%氯化钠从核蛋白中分离出核酸(钠盐形式)，此核酸钠盐，加入乙醇可以被沉淀析出。 析出的核酸(DNA与RNA)均由单核苷酸组成，在单核苷酸中含有磷酸、有机碱(嘌呤与嘧啶)或戊糖(核糖、脱氧核糖)。核酸用硫酸水解后，即可游离出这三类物质。用下述方法可分别鉴定出这三类物质： 1．磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸，磷钼酸可被氨 基奈酚磺酸还原形成蓝色钼蓝。 2．嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化 合物。 3．戊糖 (1)核糖：用硫酸使之生成糠醛，糠醛与3,5-二羟甲苯缩合 而成为一绿色化合物： (2)脱氧核糖在硫酸作用下生成β,ω-羟基-γ-酮基戊糖，后 者与二苯胺作用生成蓝色化合物： 实验步骤 (一)匀浆制备 称取新鲜猪肝(或大白鼠肝脏)5克，加入等量冰冷的 0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成匀浆后加入剩余 部分），及时剪碎。放人研钵中加入少量石英砂，研磨成 匀浆。研磨过程中，要随时将研钵置于冰中冷却。（匀浆制备一定要在低温条件下制作，操作要迅速，以避免核酸 分解。） (二)分离提取 1．将匀浆5m1置于离心管内，立即加入20%三氯醋酸5ml，用玻棒搅匀，静置3min后，以3000r/min离心l0min。 2．倾去上清液，沉淀中加入95%乙醇5m1，用玻棒搅匀。用一个装有长玻璃管的木塞塞紧离心管口，在沸水浴中加热至沸，回馏2min注意乙醇沸腾后将火关小，以免乙醇蒸气燃烧。冷却后2500r/min离心l0min。（脱脂） 3．倾去上层乙醇。将离心管倒置于滤纸上，使乙醇倒干。沉淀中加10%氯化钠溶液4ml，置沸水浴中加热8 min ，并用玻棒搅拌，待冷却以后，2500r/min离心l0min 。 4．将上层清液量取体积后倾人一小烧杯内。若不清亮可重复离心一次。 5．取等量在冰浴中冷却的95%乙醇（在冰箱中），逐滴加入小烧杯内。即可看见白色沉淀析出。静置l0min后，转入离心管3000/min，离心10min，即可得核酸的白色钠盐沉淀。 （三）DNA与RNA成分的鉴定 1．磷酸的鉴定 取试管2支，按表操作 管号 水解液 5%硫酸 钼酸铵试剂 氨基奈酚磺酸 测定 对照 10滴 — — 10滴 5滴 5滴 20滴 20滴 2．嘌呤碱的鉴定:取试管2艾，按表操作 管号 水解液 5%硫酸 浓氨水 5%AgNO3 测定 对照 20滴 — — 20滴 数滴使呈碱性 数滴使呈碱性 10滴 10滴 3．核糖的鉴定 取试管2支，按表操作 将2支试管放入沸水浴内加热10min 管号 水解液 5%硫酸 3，5二羟甲苯试剂 测定 对照 4滴 — — 4滴 6滴 6滴 4．脱氧核糖的测定 取试管2支，按表操作 将两管同时放人沸水浴l0min 管号 水解液 5%硫酸 二苯胺试剂 测定 对照 20滴 — — 20滴 40滴 40滴 二、核酸的含量测定 定磷法 定糖法