肿瘤研究常用技术平台.ppt

* 基因表达检测PCR 终点法PCR 实时定量PCR * 基因表达检测 Northern杂交 Northern杂交检测基因表达(mRNA、miRNA )的金标准 * 蛋白质组学 基因翻译在时间和空间上持续变化的动态过程。 蛋白质组学：系统研究在一定生理条件下组织或细胞内蛋白质存在状态的一门学问。 * 蛋白质表达水平检测 双向电泳： 等电点电泳按所带电荷分离 SDS依据分子量大小分离 * 蛋白质表达水平检测 Western blot 免疫组化 * 细胞增殖检测 活细胞计数，绘制生长曲线（growth curve）台盼蓝染色 活细胞：细胞膜完整且能将染料外排 死细胞：呈蓝色 * 细胞增殖检测 染料法：MTT、Alarma Blue等 活细胞代谢染料分子，转变为不同颜色的产物，通过检测代谢产物的量，反应细胞活力（viability）。 * 细胞增殖检测 细胞周期检测：检测细胞的DNA含量，反映细胞所处的细胞周期 细胞周期 G2 M G0 G1 s * 细胞增殖检测 BrdU标记法： BrdU是胸腺嘧啶类似物,在复制过程中（S期）被细胞摄取并插入新合成的DNA中，通过检测含有BrdU渗入的细胞，能确定处于S期的细胞比例。 * 肿瘤细胞恶性增殖检测 低密度生长能力 锚定非依赖性生长 体内成瘤能力 * 低密度生长的能力 * 锚定非依赖性生长与恶性转化 锚定非依赖性生长：不依赖与固体底物接触的细 胞增殖能力。 体外检测细胞恶性转化的标志：软琼脂试验 转化细胞 未转化细胞 * 体内成瘤能力检测 常用实验动物：裸鼠(nude mice) 裸鼠是1966年以来发现和培育的一种小鼠突变系，先天无毛、无胸腺、T淋巴细胞功能缺乏，对异种移植不产生排斥反应，因此适用于异种动物组织的移植和人类肿瘤异种移植。 * T、B淋巴细胞联合免疫缺陷动物 外观与正常小鼠无异，生长发育正常，但胸腺、脾、淋巴结的重量为正常的30% 对于人类肿瘤的移植成活率高达36.9％，而一般裸鼠为16.9％。 体内成瘤能力检测 常用实验动物：SCID （severe combined immunodeficiency disease, SCID）小鼠 * 体内成瘤能力检测 皮下接种(subcutaneous, s.c.) 　 在动物皮下接种新鲜肿瘤组织或肿瘤细胞系。 原位移植(orthotopic transplantation ) 　 将适量的肿瘤细胞接种于动物相应的器官组织。 * 细胞凋亡检测 细胞核形态检测：DAPI、PI、Hochest 细胞凋亡的特性： 染色质凝聚 染色质片段化 核皱缩 出现凋亡小体 * 细胞凋亡检测-Annexin V / PI 染色 正常状态下：PS位于脂膜的内层 早期凋亡：脂膜翻转，PS位于外层脂膜 凋亡后期以及细胞坏死：膜通透性增强 * TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling): 基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素(FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。 细胞凋亡检测-TUNEL检测 * 细胞凋亡检测 标记性分子检测细胞色素C的释放、Caspase-3/7的切割活化 * 肿瘤转移研究的常用方法 1、肿瘤细胞体外迁移实验 2、肿瘤细胞体外侵袭实验 3、体内肿瘤转移模型 * 肿瘤细胞体外迁移实验-划痕法 借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，测定肿瘤细胞的爬行运动能力。 对照组 实验组 * 对照组 实验组 肿瘤细胞体外迁移实验－ Transwell 小室法 体外培养的肿瘤细胞在趋化物质（如血清）作用下可以穿过多孔膜，穿膜细胞经过染料染色，以便于在镜下计数。 * 将matrigel铺在Transwell 侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的结构。具侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可穿过多孔滤膜及matrigel ，侵袭细胞经染色后，在显微镜下观察和计数。 肿瘤细胞体外侵袭实验- Transwell 小室法 * 箭头所指示为Matrigel 左图为低倍镜右图为高倍镜 Tumour cell-induced vascularity in the in vivo Matrigel plug assay. CT-2A tumour cells in Matrigel were