小鼠肠道细胞提取完整版.docx

HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】 小鼠肠道细胞提取 小鼠结肠固有层单个核细胞(LPMCs)提取及细胞表面染色 成功麻醉小鼠后，取血并脱颈处死，取出结直肠肠道切成4 cm~5 cm每段，置于预冷的1×PBS中； 镊子固定肠道组织一侧，去除排泄物，切除剩余的肠系膜脂肪组织和派尔集合淋巴结（Peyer’s patches, PPs）； 将结肠纵向剪开，用预冷的1×PBS清洗排泄物后，将肠道切成1 cm大小（可在Tube管内剪），2000 rpm离心5 分钟，弃上清； 将组织收集到装有5 ml消化液的50 ml 离心管中，37oC培养箱中80转缓慢旋转孵育25分钟；（消化液的量由消化效果和组织数量决定） 孵育过程中每10分钟震荡离心管20秒，孵育完成后，再强烈的涡旋震荡细胞悬液20秒，并用70 μm的细胞筛网过滤细胞至50 ml离心管中，收集细胞冰上放置（或加PBS终止反应）； 收集细胞筛网中剩下的肠道组织至50 ml 离心管中，加5 ml 消化液。37oC培养箱中60 g缓慢旋转孵育25分钟；重复第8-9步，将组织消化完全，直至在过滤器中不出现肉眼可见的粘连组织块(一般反复消化共3次即可)； 将多次消化后的单细胞悬液合并在50 ml离心管中，3500 rpm离心5 分钟后弃上清； 用FACS缓冲液（或PBS）重悬细胞沉淀，3500 rpm离心5分钟后弃上清； 6 ml 40% percoll重悬细胞沉淀，后用巴氏吸管将细胞悬液小心加入到含3 ml 80% percoll的15 ml离心管中（percoll的量：一般3只鼠对应1份percoll）； 1000 g 20oC离心20分钟(升5降0)。离心后，可见白色的LPMCs细胞层在两层分离液之间； 用PBS洗一次，1800rpm，，离心，弃上清； 1×PBS重悬细胞，计数。 1.消化液的配制 Reagent Final concentration Collagenase D mg/ml DNase I mg/ml Dispase II 3 mg/ml 小鼠肠道组织消化液配置体系(现用现配,用前37℃水浴) Percoll的配制（需要在无菌环境中，以7份为例）： 40%percoll= 6ml×7=42ml ≈45ml 【即18ml母液+ 27ml 1×PBS，2/5+3/5】 80%percoll= 3ml×7=21ml ≈20ml 【即16ml母液+ 4 ml 1×PBS，4/5+1/5】