基因编辑技术文档.docxVIP

基因组编辑技术是必威体育精装版发展起来的植物基因功能研究及定向育种的重要手段。在植物中实现基因组编辑的常规方法是将序列特异性核酸酶（如CRISPR/Cas9）的编码DNA转化植物细胞，稳定表达进而实现对目的基因的定点编辑。这种情况下，CRISPR载体整合在植物染色体中，需通过后代分离获得不含CRISPR/Cas9 DNA的植株。由于此过程涉及转基因植物，因此生物安全性可能会受到一定的质疑；同时，CRISPR/Cas9 DNA的稳定表达会增加脱靶以及嵌合体发生的概率。此外，对于转化困难的植物基因型、物种和营养繁殖的植物，这种基于植物稳定遗传转化的基因组编辑技术路线就暴露其局限性。 为了解决这些问题，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组在植物中率先建立了基于CRISPR/Cas9瞬时表达的基因组编辑体系。该研究通过CRISPR/Cas9 DNA或RNA瞬时表达，对六倍体小麦及四倍体小麦的7个不同基因进行了定点敲除，突变效率为1.0%-9.5%，且在T0代得到了不含外源基因的小麦纯合敲除突变体。瞬时表达CRISPR/Cas9的基因组编辑技术体系与常规的基因组编辑技术体系的定向突变效率相似。对突变体植物中32个潜在脱靶位点进行分析，发现通过瞬时表达CRISPR/Cas9 DNA或CRISPR/Cas9 RNA获得的突变体中均未发生脱靶效应，证明这两种方法具有更高的特异性。通过瞬时表达CRISPR/Cas9 基因组编辑技术体系获得的突变能稳定遗传，纯合突变体表现出相应的预期表型。 瞬时表达，即瞬时转染后的初期，质粒或DNA片段是游离在细胞中的，能够进行表达，称为瞬时转染表达。随后，游离在细胞中的质粒或DNA片段有两种归化，一种是被降解，还有一种是插入染色体中而能够持续地稳定地表达。 植物瞬时表达系统 当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达（transient expression）和稳定表达（stable expression）两种。在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的DNA整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转化细胞。基因的导入方法可分为间接转基因方法和直接转基因方法。 转染(transfection)是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。?从本质上讲，和转化没有根本的区别。无论是转染还是转化，其关键因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易进入细胞内部。所以在习惯上，人们往往也通称转染为广义的转化。常规转染技术可分为瞬时转染和 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 稳定转染（永久转染）两大类。 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 宿主 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 染色体中，因此一个 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 启动子和其它调控元件的分析。一般来说， \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白， \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 选择性标记，如来氨丙基 \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 转移酶（APH； \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 新霉素抗性基因）， \t /item/%E8%BD%AC%E6%9F%93/_blank 潮霉素B \t /ite