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01654 生物化学及生物化学检验(二) 临床生物化学检验技术2019 第二章 临床生物化学检测方法如何分级？ 通常根据其准确度与精密度的不同分为三级。 (一)决定性方法 决定性方法也称为一级参考方法，是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。 （二）参考方法 参考方法也称为二级参考方法，是指准确度与精密度已经充分证实、干扰因素少、系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计、有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析测量范围的分析方法。参考方法可溯源到决定性方法。 （三）常规方法 常规方法是指性能指标符合临床或其他目的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析测量范围，而且经济实用的方法。常规方法主要供临床常规检验使用，常规方法可以不是唯一的。 临床生物化学检测方法的选择应考虑哪些因素？ 临床实验室在引入新的方法或修订旧的方法，并使之成为临床常规方法时，通常包含以下步骤：确定检测需求、选择或建立候选方法、设定质量目标、方法学评价、方法的实施、临床样本的常规检测、质量控制及结果报告等(图2-1）。其中，方法的选择与评价是十分关键的步骤。如果新方法涉及自动分析仪的使用，还要包括自动分析仪特征参数的评价。 （一）确定检测需求：1.临床需求 2.方法的分析性能要求 3.自动分析仪的性能要求 （二）候选方法的选择：1. 根据方法性能选择 2.根据所需条件设备选择。 第四章 酶活性：酶是活细胞赖以生存的基础，其主要功能是生物催化作用。酶所催化的反应物称为酶的底物S，其生成物称为产物P，酶的催化能力的大小称为酶的活性。酶的催化作用与其特殊的组成、结构和性能有关。 表示方法：用活性单位表示，常用的酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。 酶活性国际单位:在特定的条件下，1分钟内转变1微摩尔底物的酶量为一个国际单位，以IU表示，即1IU= 1umol/min。 1katal= 60x106U ,1umol/min= 16.67nmol/s = 16.67nkatal。 定时法：指测定酶促反应过程中某一段时间内底物的消耗量或产物的生成量，计算出该时段内的平均反应速度,再换算成 umol/min ，以此代表待测酶的活性浓度。 一般是在反应一开始即计时,到达设定时间时加入终止剂(强酸、强碱、蛋白沉淀剂等)终止酶促反应，测定这段时间内底物或产物浓度的变化，因此，不仅底物或产物浓度的测定要准确,还必须计时准确。 底物选择原则 （1）尽量选择Km最小的底物，最好是酶的天然底物 （2）要有足够的溶解度 （3）酶对底物特异性高 （4）底物稳定性好 （5）有较高的临床价值 底物浓度的确定 酶的米氏常数(Km值)是酶促反应速度达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度,用mol/L表示，大多数酶Km在10-3 ~ 10-5 mol/L之间。Km值是选择底物浓度的关键参数之一，代表了酶对底物的亲和力, Km越小表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。 (1)单底物酶促反应：根据 Michaclis-Menten 方程很容易得出以下结论：若[S]= 10Km，则反应速度达到最大反应速度的90.9%;若[S]=20Km，则反应速度达到最大反应速度的95.2% ；只有当[s]无穷大时，反应速度才达到最大反应速度，这在实际工作中是不可能的。因此，底物浓度的确定原则是选择[S]= 10~ 20Km，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差可以接受。 (2)双底物酶促反应：双底物酶促反应动力学与单底物相比更复杂，底物浓度的确定要以动力学方程为基础，用乒乓机制、序列有序机制和随机机制等进行分析。双底物酶促反应速度达到最大反应速度的程度一般 要求为90%~95% ，根据不同机制的动力学方程，可以求出两底物的用量。 酶质量免疫化学测定法的评价 与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：①灵敏度高,能测定样本中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶；②特异性高，几乎不受体液中其他物质,如酶抑制剂、激活剂等的影响；③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；④特别适用于同工酶的测定。 酶的免疫化学测定也有其局限性，主要表现在：①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，且工作量较大；②测定步骤多，操作烦琐；③测定成本高。 工具酶：是酶学分析中作为试剂用于测定其他化合物浓度或酶活性浓度的酶。 如：DNA限制性内切酶、连接酶、聚合酶、核酸酶、修饰酶。在利用工具酶的反应中，一般将工具酶及其辅助底物设定为过量，而将待测化合物或待测酶设定为限速因素。许