第三章基因工程第一节基因工程工具酶wangjx.pptx

第一节 基因工程中的工具酶;一、限制性内切酶;（一）、限制修饰系统的种类;（二）、限制性内切酶的定义、命名;（三）、限制酶的特点; ３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2.??末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’ 粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子; ３）?平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’ ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG-3’ CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG ; ;5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’; 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘;酶切条件：酶切缓冲液;（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）;（五）、 限制酶的用途;酶切图谱的构建（a）;酶切图谱的构建（b）;二、DNA甲基化酶（一）、 甲基化酶的种类与识别顺序;2.???? II型甲基化酶对限制酶活性的影响 １） 抑制同种限制酶的活性 M.BamHI GGATmCC—BamHI(G?GATCC) M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(G?AATTC) ２） 抑制不同种限制酶的活性 a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA） b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG） ３） 抑制不同种限制酶的部分活性 M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC 3.???? 甲基化酶的用途 １） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ２） 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切;;三、核酸酶（一）、外切酶III（ExoIII）; 3.??外切酶活性特点 1) 反应底物：互补ds-DNA 2) 碱基释放速度：CA-TG 3) 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 4.??用途 1)??? 核酸（DNA）标记 2)??? 基因突变-