细胞的分离技术与细胞纯化课件.ppt

⑤溶液以 2000g 离心 10min ? ⑥弃上清液，沉淀物悬浮于 240ml 溶液中，以 2000g 离心 10min ? ⑦弃上清液 , 沉淀悬浮于 190ml 溶液 B （ 2.2mol/L 蔗糖， 10mmol/L Tris-HCl) 中 ? 取超速离心管，每管加 5ml 溶液 B ，以 25000rpm 离 心 60min. ? ⑧弃上清液 , 用溶液 A 轻轻荡洗管壁沉淀物表面两次， 将离心管倒置，用滤纸拭干管口 ? ⑨向离心管底部加几滴溶液 A ，用玻璃棒轻轻搅匀， 然后补充加 30ml 溶液 A 。 ? ⑩以 2000g 离心 20min, 弃上清 , 沉淀物为干细胞核 ? ? 匀浆器 ? 2 、细胞膜的分离法 ? 细胞膜是围绕在细胞质外的一层单位膜，它提供 细胞进行生命活动的基本屏障性结构和功能成分， 对外分隔细胞内外环境。 ? 分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。 ? 一般说，红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心 法即可达到要求，其他细胞膜以及各种细胞器膜 的制备则可根据各种膜组分的密度大小不同，采 取梯度离心，经离心沉降分离得到纯制品 ? 步骤： ? 全部操作须在水浴中进行，所用浴液须预冷至 4 0 C 。 ? ①大鼠在实验前禁食一夜，断头处死，剖腹切 取肝脏组织约 10g ，用蔗糖 -Tris 溶液清洗，并 用剪刀剪碎。 ? ②用玻璃匀浆器分次匀浆肝组织，每次大约 2.5g 肝组织碎块，悬浮于 40ml 蔗糖 -Tris 液中 进行匀浆。最后合并匀浆液补加蔗糖 -Tris 液 至 250ml 。 ? ③匀浆液通过 4 层纱布，除去组织粗渣。 ? ④肝组织滤液以 15000g 离心 15min. ? ⑤吸出上清液，将沉淀物悬浮于适量的蔗糖 -Tris 液中，再次匀浆，补加蔗糖 -Tris 液至 75ml, 再加 10.1ml 分离剂和 1.45ml 的 2mol/L 蔗糖，充分混匀 ? ⑥ 35000g 离心 20min ? ⑦离心完毕，细胞膜在近管顶分离剂中清晰可见。 吸出这一层用蔗糖 -Tris 液稀释到 75ml 并匀浆，再 加 10.1ml 分离剂和 1.45ml 的 2mol/L 蔗糖和 100mmol/LCaCl 2 至终浓度 1.3mmol/LCaCl 2 管底 ? ⑧ 45000g 离心 30min, 膜被分离，而 DNA 沉积在 ? 3 、线粒体及线粒体膜的分离 ? 线粒体普遍存在于各种真核细胞中， 他是细胞呼吸的主要场所 。 ? 细胞活动所需能量主要靠在体内进行 的氧化所产生的能量。 ? 线粒体的分离方法主要是差速离心分 离。 ? 线粒体分离步骤： ? ? 全部操作须在水浴中进行，溶液须预冷 ①将体重约 200g 的大鼠断头处死，迅速取 5g 肝脏， 在水浴中剪碎，加入 10 倍体积的分离介质，在玻璃匀 浆器中匀浆。 ②匀浆液通过双层纱布以除去组织碎渣。 ? ? ? ? ③滤液以 800g 离心 10min ，使细胞及细胞碎片沉降。 ④吸出上清液，以 8200g 离心 10min ⑤去上清液，沉淀重悬浮于洗涤介质中，用玻璃棒搅 匀。 ⑥ 8200g 离心 10min, 沉淀的为线粒体。 ? ? 线粒体膜分离步骤： ? 线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心。 ? 全部操作在冰浴中进行，溶液须预冷。 ? （ 1 ）纯化的线粒体悬浮在 10mmol/L 磷酸缓 冲液， pH7.4 中，膨胀 20min ，再以 105000g 离心 60min, 弃上清液，沉淀内外膜。沉淀重 悬浮于 0.25mol/L 蔗糖 -10mmol/LTris-HCL pH7.4 中，以 1500g 离心 15min ，上清液用于 分离线粒体外膜，沉淀用于分离线粒体内膜。 ? ? （ 2 ）线粒体外膜的分离： ①吸取（ 1 ）中的上清液，以 105000g 离心 60min ，弃 上清液，沉淀重悬浮于 0.25mol/L 蔗糖 -10mmol/LTris- HCL 溶液中。 ②用带长针头的注射器分别吸取 3ml 的 25.2% 、 37.7% 、 51.7% 蔗糖溶液，并叠层铺在超速离心管中，制备不连 续的密度梯度。 ③吸取 2ml 样品液小心加在 25.2% 蔗糖溶液的界面上。 ④以 165000g 离心 45min, 线粒体外膜处在样品液与 25.2% 蔗糖溶液的交界面上，用注射器收集线粒体外膜 ? ? ? ? （ 3 ）线粒体内膜的分离 ? ①把 11500g 离心 15min 后的沉淀物重悬浮于适 量的 25.2% 蔗糖溶液中。 ? ②用注射器吸取 2ml25.2% 蔗糖溶液，另外分别 吸取 2.5ml 的 37.7% 、 51.7% 、 61.5% 的蔗糖溶 液，然后依次叠加在超速离心管中，制成不连