大肠腺癌中EphA2表达与临床病理学因素.pptx

EphA2在大肠腺癌中的表达第一部分大肠腺癌中EphA2表达及其与临床病理学因素、DNA倍体、细胞周期关系的研究EphA2基因的介绍EphA2是Lindberg于1990年用简并引物从人角化细胞cDNA文库中筛选得到的一个Eph（Erythropoitin-produceing hepato-cellular,Eph) 亚家族成员 。人EphA2基因定位于1p36.1,有17个外显子。 Eph受体家族是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家庭。 Eph家族受体激酶和他们EFN配体介导的细胞信号传 导参与神经系统的基本发生过程、神经系统的信号传 递，在细胞的分化、发育、增殖，组织和器官的形成、血管生成、细胞与细胞之间的粘附及肿瘤的发生和肿瘤的新生血管的形成等过程中发挥重要的和必不可少的作用。 EphA2与肿瘤的关系EphA2广泛高表达于不同的肿瘤组织和细胞系，如：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌，肾细胞癌等，目前认为EphA2参与肿瘤的发生和发展，是功能强大的癌基因。 EphA2的高表达能诱导非转化乳腺和前列腺上皮细胞在体内、外的恶性转化，并促进其侵袭转移 。应用EphA2蛋白的抗体靶向抑制试验，下调EphA2蛋白表达的同时，也抑制了肿瘤细胞的生长，进而降低肿瘤的恶性程度 。实 验 标 本154例大肠腺癌组织和相应正常大肠粘膜组织均来自郑州大学第一、二附属医院和河南省肿瘤医院2001年1月~2004年12月手术切除标本的存档蜡块 (其中66例为手术切除新鲜标本和蜡块和88例存档蜡块) 1份置4%多聚甲醛中固定存放另2份置-82℃中存放石蜡包埋、切片、HE染色石蜡包埋、切片，进行免疫组化提取总mRNA、进行RT-PCRFCM检侧DNA倍体、细胞周期细胞增殖率临床病理资料 154例（88例存档石蜡包埋标本和66例手术切除新鲜大肠腺癌标本）大肠腺癌患者，术前均未接受化疗、放疗及其他治疗。其中男性 78例，女性 76例，年龄在 23-85岁之间，平均年龄为 49.7岁。 66例新鲜手术切除标本均为大肠腺癌：分化程度:高分化腺癌30例，中分化腺癌23例，低分化腺癌13例。浸润深度:粘膜层10例，粘膜下层0例，肌层14例，浆膜层37例，外周组织5例。转移：有淋巴结转移者16例，无淋巴结转移者50例；有血道转移者1例，无血道转移者65例；无种植性转移。 88例存档蜡块全部为腺癌:分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌18例，低分化29例和未分化20例；浸润深度：粘膜层62例，粘膜下层1例，肌层17例、浆膜层5例，外周组织3例；转移：有淋巴结转移者14例，无淋巴结转移者74例；有血道转移者11例，无血道转移者77例；有种植性转移者10例，无种植性转移者78例 。技 术 路 线免疫组化（SP法)FCMRT-PCR技术检测66例大肠腺癌手术切除新鲜组织和相应正常大肠粘膜手术切除新鲜组织中DNA倍体、细胞周期、细胞增殖率检测66例大肠腺癌手术切除新鲜组织和相应正常大肠粘膜手术切除新鲜组织中EphA2mRNA表达检测154例大肠腺癌组织和相应正常食管组织中EphA2蛋白表达探讨EphA2表达与大肠腺癌病理临床因素、DNA倍体、细胞周期的关系实 验 方 法一. 免疫组化 步骤 （略） 对照组设计：以已知EphA2阳性食管鳞癌和正常食管粘膜腺体组织切片作为阳性对照，用正常兔IgG代替一抗作为阴性对照，用PBS代替一抗作为空白对照。 免疫组化结果判定及定量分析：EPhA2免疫组化阳性表达位于细胞胞浆，呈棕黄色。定量分析采用高清晰图像处理系统，随机取10个高倍视野进行图像分析，对免疫组化切片检测EphA2阳性细胞数，依据阳性细胞所占肿瘤细胞面积的百分比和染色强度判断结果。实 验 方 法二 .组织中总RNA的提取及RT-PCR 步骤 （略） RNA浓度的测定 （略）对照设置 ：（1）阴性对照：以去离子水代替提取 的总RNA，结果阴性。（2）内参对照：用β-actin作为内参引物，与EphA2和KAI1引物分别同管扩增，结果在紫外灯下出现一条330bp的荧光带结果判定阳性判断标准为：目的EphA2基因RT-PCR产物凝胶电泳后在紫外灯下分别出现一条586bp的荧光带。FCM实验步骤：取大肠腺癌和正常大肠粘膜组织0.5g剪碎100、300目尼龙网上搓上机检测Stain 1ml避光30min.收集细胞液，800prm/min离心2min LPR染液,避光冷藏(4℃)5min 70%乙醇(4℃)中固定1hFCM对照组设计和诊断标准： 设正常对照组：用正常人外周血淋巴细胞，即二倍体细胞作为DNA含量和肿瘤细胞DNA倍体、细胞周期的参考标准 DNA倍体分析:用Partec流式细胞仪,计数10