细胞毒实验专业课件.ppt

可健 季 李;细胞毒检测技术主要根据原理不同进行区分;;补体依赖的细胞毒实验;抗体依赖性细胞介导细胞毒实验（ADCC）： ;细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定;淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测定;肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定;血红蛋白酶释放法（HbE-Assay） 同位素释放法： 51Cr、125I-UdR 、3H-TdR　等　 乳酸脱氢酶释放法 MTT比色法 测定法 ;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。*** 10、低头要有勇气，抬头要有低气。**** 11、人总是珍惜为得到。***** 12、人乱于心，不宽余请。**** 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。***** 14、抱最大的希望，作最大的努力。**** 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。***** 16、业余生活要有意义，不要越轨。*** 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。****;;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。*** 10、低头要有勇气，抬头要有低气。**** 11、人总是珍惜为得到。***** 12、人乱于心，不宽余请。**** 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。***** 14、抱最大的希望，作最大的努力。**** 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。***** 16、业余生活要有意义，不要越轨。*** 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。****; 原 理;NK细胞分离方法; 同位素释放法; 同位素释放法;应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。;Cr标记靶细胞;本法结果准确、重复性好，但存在以下不足： ①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器； ②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定； ③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验。 ④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素??定法。;本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定，其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假阳性结果。;乳酸脱氢酶释放法-原理; 乳酸脱氢酶释放法;无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640（无FBS);单细胞悬液的制备 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 细胞计数： 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml 注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。;细胞培养： 按图所示加板。 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%CO2培养箱中，培养2小时。 LDH底物： 在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。 室温避光保存15min。 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30?l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 结果测定： 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。 结果判定： Max （ 靶细胞最大释放）=