细胞划痕专业课件.ppt

细胞划痕实验; 一、基本原理 细胞划痕（Wound Healing ）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如24h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否迁移（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，可以判断各组细胞的迁移与修复能力 ? ;二、实验步骤 准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。2.在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，不同孔之间最好使用同一枪头。4.用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清或低血清培养基。5.放入37度5% CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。;culture Insert 方法（保证划痕的均一度） 1. ?准备细胞，培养液。 2. ?如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500 μm宽度的划痕。 3. ?每隔4-6小时拍照记录。 4. ?根据收集图片数据分析实验结果。;5;三、实验结果 统计方法：使用Image?J软件打开图片后，随机划取6至 8条水平线，计算细胞间距离的均值，测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。 其他结果分析工具：Wound Healing Image Analysis – WimScratch http://dxy.me/UfYzii Image?Pro?Plus;7;划痕结果图;0h;10;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。*** 10、低头要有勇气，抬头要有低气。**** 11、人总是珍惜为得到。***** 12、人乱于心，不宽余请。**** 13、生气是拿别人做错的??来惩罚自己。***** 14、抱最大的希望，作最大的努力。**** 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。***** 16、业余生活要有意义，不要越轨。*** 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。****;;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。*** 10、低头要有勇气，抬头要有低气。**** 11、人总是珍惜为得到。***** 12、人乱于心，不宽余请。**** 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。***** 14、抱最大的希望，作最大的努力。**** 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。***** 16、业余生活要有意义，不要越轨。*** 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。****;? ;举例：抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法） ;三、实验步骤 1．制备单层细胞：细胞密度5~10×105 /mLHep G2细胞铺于24孔板（每孔500 uL）上，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液培养16~24 h,使形成单层细胞 2．划痕 ：以五氟尿嘧啶（5－Fu）为例，首先配制1 μg/μL母液(使用无菌蒸馏水配制，精密量取），取45 μL该母液用PBS稀释至1.1 mL，得浓度40 μg/mL5－Fu溶液 ，用10 uL移液枪枪头（或者无菌牙签）在单层细胞上呈一字划痕，用PBS清洗3次，然后加入上面配好5－Fu溶液，平行两个样本，孵育24 h，换成含10％胎牛血清的DMEM培养液孵育24 h 3．观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗3次，倒置荧光显微镜下观察并拍照 ;17;四、注意事项： 1． 实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴 壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。 2． 用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，免冲散单层贴壁细胞影响实验拍照结果。 3． 药物筛选过程，其对细胞迁移能力影响也是重要的一方面，实验设计过程需 要选择适当阳性对照组和阴性对照组。 ;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。*** 10、低头要有勇气，抬头要有低气。**** 11、人总是珍惜