菌种的复苏传代及保存标准程序.pdf

菌种的复苏传代及保存标准程序 目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内 进行。操作中使用过的滴管、 吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡， 试验结束 后经 121℃30 分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 1.1 冻干菌种的复苏 检定用标准菌种， 由中国药品生物制品检定所提供， 为冷冻干燥菌种 ( 0 代) 。 使用前需将其复苏。 1.1.1 准备： ①用具：灭菌 1ml 滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基： 根据菌种的性质选择合适的液体培养基 （营养肉汤培养基或改良马丁 培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液： 75%酒精、碘酒、 0.1%新洁尔灭或 84 消毒液等。 1.1.2操作： 1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、 灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、 培养基移入工作台。 1.1.2.2 用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕， 再 75%酒精棉擦净菌种管外壁， 放在 灭菌双碟内待干。 1.1.2.3 点燃酒精灯， 将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热， 用灭菌滴管吸取 液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1.2.4 取灭菌镊子， 在火焰旁， 将炸裂的管口打开后， 把菌种安瓿放入灭菌双碟 内。 1.1.2.5 另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许， 加至菌种管底部， 将 冻干菌搅动促使溶解， 随即吸出管内菌液， 接种至液体培养基内。 用接种环取菌 液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1.2.6 将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在 30~35℃，真菌在 23~28℃）培养 24h。 1.1.2.7 取出培养物（第 1 代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、 革兰氏染色镜检， 若呈典型菌落即可应用。 如发现菌型不典型， 可进行平板分离 单菌落。 1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过 5 代，并减少购买冻干菌种的次数， 可 在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液 （第1 代）冷冻保存， 并将此冻存菌液 复苏后的第 2 代培养物冻存保藏。 1.2.1 准备 ：①冻存保护液（ 40%无菌甘油）及灭菌冻存管。 ②细菌冻存液： 由液体培养基与冻存保护液按 1：1 比例混匀制成。 1.2.2 按 1.1.2.1~1.1.2.4操作，将冻干菌复溶后， 吸取菌悬液加入到细菌冻存液中， 混匀。 1.2.3 按 1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。 置-20℃或-80℃条件下冷冻保存。 1.2.4 制备第 2 代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第 1 代冻存菌悬液复苏后 转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落， 再接种至细菌冻存液中， 混匀后 按 1.2.3 冻存。 1.3 冻存菌悬液的复苏： 1.3.1 准备： ①用具：灭菌 1ml 滴管、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基 10ml、 硫乙醇酸盐流体培养基 12ml 或改良马丁培养基 10ml 等）、琼脂斜面或平板培养 基。 ③消毒液： 75%酒精、 0.1%新洁尔灭或 84 消毒液等。 1.3.2操作： 1.3.2.1 从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。 1.3.2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。 1.3.2.3 用 75%酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁，稍干。 1.3.2.4 点燃酒精灯， 在火焰旁打开菌种冻存管盖，