马铃薯品种鉴定----分子标记检测.docx

ICS 65. 020. 01 B05 DB5301 昆 明 市 地 方 标 准 DB5301/T 26—2019 代替 DG5301/T 26-2017 马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定 DNA分子标记 2019T2-01 发布 2019T2-01 实施 昆明市市场监督管理局 发布 DB5301/T 26—2019 本标准按照GB/T 1. 1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由昆明市农业局提出并归口。 本标准起草单位：云南师范大学马铃薯科学研究院、昆明市农业科学研究院。 本标准主要起草人：唐唯、易靖、李灿辉、朱维贤、段晓艳、郝大海、刘卫民、邹万君、李华、 张仲平、李明富、张丽芳、蒋瑜、杨春利。 本标准代替了DG5301/T 26-2017。 DB5301/T 26—2019 DB5301/T 26—2019 PAGE PAGE # DB5301 DB5301/ 26—2019 PAGE PAGE # 马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA分子标记 1范围 本标准规定了DNA分子标记鉴定马铃薯(Solanu tuberosum L.)品种的方法。 本标准适用于马铃薯品种真实性鉴定和种薯纯度检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于 本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 18133马铃薯种薯 GB/T 28660马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记 3术语和定义 GB/T 28660和以下术语及定义适用于本文件。 3. 1 简单序列重复 基因组中由1?6个核昔酸残基组成的基本单位串联多次重复构成的DNA序列。 [GB/T 28660,定义3. 1] 3. 2 聚合酶链式反应 在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。 [GB/T 28660,定义3. 2] 3. 3 毛细管电泳 是一类以毛细管为分离通道、以高医直流电场为驱动力的新型液相分离技术。 3. 4 DNA分子标记 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 3. 5 标准品种 按国家农作物品种审定标准认定的品种。 4仪器用具、试剂和软件 4. 1仪器及用具 用本方法进行试验时，需要仪器、用具如下: PCR仪（96孔，梯度）； 低温高速离心机（4 °C, 16 000 rpm/min）； ——冰箱（-20 C, -80 C）； 制冰机（200 kg/天~300 kg/天）； ——高压灭菌器（121 C, 0. 15 MPa）； ――凝胶成像仪； ——电泳仪； ——水平电泳槽； 基因分析仪（Genetic ――紫外可见分光光度计 ——0. 2 mL PCR 管； ——96孔测序板； 石英比色皿。 ——微量移液器（0.5也?10也、10叫?100也、100也?1 000也）及配套的枪头;B)；(10 meelyze ——微量移液器（0.5也?10也、10叫?100也、100也?1 000也）及配套的枪头; B)； (10 m ee lyze 90 nm 方法见附录 C DNA p 和配套的P ymerase 4.2试剂 ――常用贮备液 DNA提取试剂（制 DNA分子标记引 Taq DNA聚合酶 1 000 bp DNA Marker； ——无DNA酶的RNA村- ——异丙醇；■ ——乙醇（70%）? ——灭菌双蒸水lddH2 甲酰胺（HIDD .: ——八子量内标（GJi at缓冲液；mL）荐中 7T丁里n十小、聲1 烏LIZ at 缓冲液； mL）荐 中 7T丁里n十小、聲1 烏LIZ ),； ——EB 染液(100 mL 1X 1^1? + 4.3软件 5供试材料5.1取样：按照GB 18133取样所述方法进行，采集大田植株叶片或块茎作为检测样品。 5供试材料 5.2样品保存：选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-80 °C以下）中保存备用（有效保 存期小于等于6个月）。 6鉴定程序 6. 1总DNA提取 按下列顺序进行 a） 称取100 mg待测样品，置于预冷2.0 mL离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。 b） 依次加入700叫的两倍十六烷基三甲基漠化铵缓冲液（CTAB缓冲液）（见附录B表B. 1）和 2叫的筑基乙醇涡旋混匀。置65。水浴1 h,期间每隔10 min摇动混匀一次。 c） 冰上冷却约10 min后，加入700叫的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（见附录B表B.2），涡 旋混合，轻缓颠倒混匀数次。 d） 12 000 rpm离心5 min。吸取上层水相至新1. 5 mL离心管中，加入等体积（400应?500