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各类层析的原理和载体（按分离原理分类） 类别 分离原理 基质或载体 吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝 、羟基磷酸 分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土 、硅胶 凝胶层析 分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex 离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂 、纤维素、 葡聚糖 亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的sepharose 特殊亲和力 或sephadex 聚焦层析 等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B） 吸附层析（absorption chromatography） 原理： 以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。 载体 ： 硅胶 氧化铝 羟基磷石灰 应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质 分配层析 原理： 分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。 载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶 应用：各种生化物质的分离鉴定 离子交换层析（ion-change chromatography） 原理 基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂 应用 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分 1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合 2.吸附阶段：样品与反离子进行交换 3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质 5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用 1 2 3 4 5 原始缓冲溶液的反离子 样品溶液 梯度浓度 离子交换层析演示 亲和层析（affinity chromatography） 应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能 + 待纯化分子 配体 a. 待纯化分子和配体间具有亲和性 + 基质 b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 + + 杂质 c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离 + d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子 原理： 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 亲和层析演示 聚焦层析（Chromatofocusing） 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。 层析时的聚焦效应示意图 pH梯度溶液的形成示