第三章 免疫组化细胞凋亡检测.pptx

第三章 细胞凋亡(Apoptosis) 及其形态学检测方法;细胞死亡=细胞凋亡？ (cell death) (apoptosis);How did that happen?;-八种模式生物之一：线虫 ■ PRIZED： Brenner, Sulston and Horvitz shared Physiology or Medicine Nobel Prize (2002) ■ “for their discoveries of how healthy cells carry orders to kill themselves. The discoveries involve a process called programmed cell death, which is necessary for tissue and organ development.”;Normal;紬胞開始收縮;J 细胞凋亡(Apo+ptosis) ■J-----;与necrosis 的区别？;丄与PCD的区别? ^^■programmed Cel l Death (PCD)是— 功能性概念 多用于发育生物学，指多细胞生物体中某些细胞的死 亡是预定、并受到严格控制的正常组成部分，即在发 育中预定时间空间的细胞死亡方式：如蝌蚪变态过程 、指间蹊的消失、视网膜发育以及免疫系统的正常发 育等。散在、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体 无炎症反应，对整个机体发育是有利和必须的。 细胞凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死不同 的、受到基因控制的、细胞主动死亡形式。 PCD的结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序 化的。;细胞死亡的方式;.新进展：失巢凋亡（Anoikis）;新进展：自噬（autophagy）;本章主要内容;??细胞凋亡的形态学特征;细胞凋亡的形态学特征;细胞凋亡的形态学特征;A、Normal cell;细胞凋亡的机制（简略）;tPerfoi;、.二、细胞凋亡的机制（简略） ■ Mitochondrial-mediated |pathway of apoptosis （细胞凋亡调控中心）;CIAP1;、Cytochrome。;.三、细胞凋亡的形态学检测方法 ?（一）普通光镜技术 1. 苏木精-伊红染色（HE染色） 2. 甲基绿-派洛宁染色 3. Giemsa;.（一）普通光镜技术/倒置显微镜术;(―)普通光镜技术/倒置显微镜术;AB脑皮质，CD海马CA1区。深低温停循环组（B、D） 损伤程度明显重于单纯体外循组（A、C）。;2.甲基绿-派洛宁染色;3. G i emsa染色 ______; 5.注意事项;丄^二荧光显微镜技术 ? /共聚焦扫描显微镜术 1. -PI染色 原理：碘化丙锭（PI）是能与细胞内DNA和RNA 的特异性结合荧光染料，当它与DNA和RNA结合后 ，于荧光显微镜下观察，细胞核DNA为黄色，细胞 质RNA为红色。 结果评判：细胞凋亡时，由于核浓缩或断裂，凋 亡的细胞核小且荧光染色深，细胞核或细胞质内可 见浓染致密的颗粒块状荧光。;注意事项;（二）荧光显微镜技术 JJ—— /共聚焦扫描显微镜 2.其他染色 原理：其他常用的DNA特异性染料有Hoechst , DAPI （为半通透性，用于常规固定细胞的染色）。 这些染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合 在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝 色荧光。 结果评判：细胞凋亡过程中核染色质的形态学改 变可分为三期： -I期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样 （creased）,部分染色质出现浓缩状态； -II a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化； -II b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。;control;吖啶橙/漠化乙锭双染（AO/EB） 早期凋亡：核绿色,斑块状 晩期凋亡：核橘红色，斑块状 坏死细胞：膜破，均质红色;（三）透射电镜技术;0.2um;.透射电镜（TEM）原理与成像图片;I.（三）透射电镜技术 1. 器材： 超薄切片机，透射电子显微镜 2. 材料和试剂： 25%戊二醛，锇酸,70%乙醇配制的醋酸双 氧铀，氧化丙烯,Epon812 ?，枸橡酸铅。 3. 操作步骤：注意锇酸剧毒;（三）透射电镜技术 control;结果分析:;(四)原位末端标记 ______ (in situ end-labeling,;酶;1.末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记;TUNEL反应原理;TUNE L实验简介;(4) 入0. 3% H2O2甲醇中30min以封闭内源性过氧化物酶。 (5) 入0. 1% Triton X-100枸橼酸钠缓冲液中 冰浴2min。 (6) PBS漂洗3次，5min/次。 (7 )加TUNE