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分子杂交分为： 点杂交 Southern blot Northern blot Western blot 学习文档 * 1.1.4 分子生物学的概念 * * * 　用限制酶切断成许多片段 直接分离基因——鸟枪法 　　将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。　　 学习文档 2 物理化学法 该法利用核酸DNA双螺旋之间存在的GC配对，AT配对这一特性，从基因组中分离目的基因的方法。 如：密度梯度离心法，分子杂交法等。 学习文档 3. 根据已知的氨基酸序列合成DNA 该方法是建立在DNA序列分析基础上的。当已知一个基因的核苷酸序列，可以按图纸先合成一个个含少量（10～15个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。 这种方法专一性最强，用计算机自动控制的DNA合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。 学习文档 4. 反转录法 首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。 这种方法专一性强，但操作过程比较麻烦，mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。 学习文档 5. PCR扩增法（聚合酶链式反应） 1985年，美国一公司开发的专利技术。能简便、快速地在体外对特定的DNA进行扩增。 1993年，获得诺贝尔化学奖。 PCR技术给分子生物领域带来一场变革。 学习文档 （1）与目的基因的DNA双链两端互补的DNA引物。 （2）热稳定性的酶，如Taq DNA聚合酶。 （3）dNTP。 （4）模板的DNA序列。 （5）buffer。 PCR的反应体系包括： 学习文档 PCR反应的过程 （1）变性。模板95℃，双链DNA 单链DNA。 （2）退火。温度降至55 ℃ ，使一对引物能分别与变性后的两条模板链配对。 （3）延伸。升温至Taq酶作用的最适温度72 ℃ ，以目的基因为模板，合成新的DNA链。 如此反复循环至30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。 学习文档 PCR 法 PCR法 学习文档 （二）DNA序列测定 DNA序列分析：指对一段DNA分子或片段的核苷酸排列顺序测定，即测定组成DNA分子的ATGC排列顺序。 1977年，F.Sanger发明双脱氧序列分析法（末端终止法）。 学习文档 双脱氧末端终止法DNA序列分析的原理 如果在反应物中加入一定量的某一种2’, 3’-双脱氧核苷酸, 例如ddTTP，就会在应当掺入dT的位置掺入ddT。由于ddT核苷酸的3’碳原子不含有羟基而不能和下一个核苷酸的5’碳原子上的磷酸根结合形成磷酸二脂键，所以DNA链就不能继续向后延伸。 学习文档 Sanger据上述原理设计了DNA测序的末端终止法。测序时要进行4个独立的反应，每个反应中有一种dNTP用32P标记，并且在4个反应中分别加入一定比例的ddATP, ddTTP, ddGTP和ddCTP。 反应一段时间后，每个反应中都会生成一系列由对应的那种ddNTP结尾的长短不一的DNA片段，而且这些片段的5’端序列是相同的。最后，将反应物变性后用电泳分离，经放射自显影后就可以读出DNA的碱基顺序。 学习文档 学习文档 二、目的基因与载体的连接 　　用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。 学习文档 三、重组DNA向受体的转化 　　要让目的基因表达，必须将它导入受体细胞并进行扩增。　　为获得目的基因的表达产物时，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。为改进某种生物时，将欲改进的生物细胞为受体。 导入 扩增 学习文档 重组DNA向受体细胞的导入方法有： 转化：将重组质粒导入受体细胞，使受体菌的遗传性状发生改变。 转染：用携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。 电转化法：（电穿孔法）对受体细胞进行短暂、高压的电泳脉冲，质膜形成nm微孔，DNA能直接通过孔，或作为孔闭合时膜组分重新分布而进入细胞质中。 学习文档 重组质粒 学习文档 转化法 感受态的出现 转化因子的吸附和渗入 转化因子的整合 1）重组D