NEPA21悬浮转染标准操作步骤.pdf

NEPA21 电转染操作步骤（悬浮转染 / 电转杯转染适用） 仪器和试剂 1. NEPA21 主机 2. 电转杯腔（ CU500） 3. 电转杯架（ CU600） 4. 电转杯（ EC‐002S，2mm 间隔，内含专用吸管） 若使用 EC‐002，需配合使用加长的电泳加样 Tips。 5. EP buffer：Opti-MEM 培养基 (Invitrogen Sku# 31985-062, 31985-070 or 31985-088) 注意事项：必须保证 Opti-MEM 培养基无抗生素，无血清。 6. 质粒 DNA （pCMV-EGFP ，储存浓度 1 μg/ μl每管，溶于 TE 缓冲液中， 由NEPA 公司提供） 7. 细胞培养板或培养皿（供电转后细胞培养用，请根据不同细胞选用合适规格的培养板 / 皿，一 般建议准备 6 孔板或 30mm dish ） 实验步骤 一、 细胞悬液的制备 6 1. 根据细胞量 1 ×10 / 管准备细胞。 2. 用胰蛋白酶消化、收集细胞；用含血清的培养基终止消化（该步骤适用于贴壁细胞，若悬浮 细胞则直接进入步骤 3 ）。 3. 离心并弃去上清，加入 EP buffer 进行重悬细胞团块。吹打几次，以洗去培养基中的血清。 4. 重复第 3 步2-3 次，最后将细胞重悬于 EP buffer 中。 注意事项： 1. 必须保证细胞悬液无抗生素、血清残留，否则会大大降低细胞的转染效率。 2. 上下吹打细胞使其成为细胞悬液，无结团。 5. 取少量悬液进行细胞计数并确定浓度，根据浓度和细胞悬液的总体积，算出总细胞数量。 二、 细胞 +DNA 混合液的制备 6 将一定量的细胞与质粒 DNA 混合，充分混匀，使其最终浓度达到每管 100 μl混合液中含有 1×10 细胞 +10 μg DNA。其中细胞体积为 90 μl，质粒 DNA 体积为 10 μl。 例如：进行 12个程序，需要准备 13 管细胞 +DNA 混合液（为避免分装损失，需多备一管） 7 所需细胞总量： 1.3 ×10 ：从已知浓度的细胞悬液中取足量的细胞，离心后用 1170 μl EP buffer 重悬。 所需 DNA 总量： 130 μg。取130 μ质粒l DNA （储备液浓度为1 μg/ ）。μl 1170 μl 细胞液 +130 μl 质粒 DNA=1300 μl 细胞 /DNA 混合液。充分混匀，不可产生气泡。 注意事项： 5 1. 如细胞总量不足，每管的细胞量可相应减少，但同时转染效率会降低。例如： 每管使用 5 ×10 细胞， DNA 用量不变，细胞 /DNA 混合液总体积仍为 100 μl； 5 2. 如每管的细胞量降低至 5 ×10 细胞仍不够做 12 个程序时，应适当删减程序。 三、 电转实验 1. 预先准备两个 6 孔细胞培养板， 或12 个30 mm 的培养皿，每孔加入 2 ml 预 热的完全培养基（含血清）。 2. 将细胞 /DNA 混合液分装至 12 个电转杯中， 100 μ杯，并做好标记。l/ 注意事项：必须准确加入 100 μl的细胞 /DNA 混合液，以保证获得相似的 电阻值，提高实验的重复性 3. 设置电转染参数。 4. 用手轻轻敲打电转染杯，使气泡上升至液面表面并清除。 5. 将电转杯放入电转杯腔。 6. 按下 “Ω”键，测定并记录电阻值。 注意事项：