细胞培养标准流程.pdf

精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（ 30 min）和房间大紫外（ 30 min ）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。 基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、 细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的 液体 均需提取 20-30 分钟从冰箱取出恢复到室温或置于 37℃的 水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤： 1.观察： 高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧： 细胞生长融合达 90%时，吸出培养基 3.漂洗： PBS （2mL ） 漂洗 1-2 次 4.消化：加入 1ml 0.25%胰蛋白酶， 轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶， 后吸去胰酶计时 CO2 放置 40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞 脱壁。 5.终止： 吸弃胰酶后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基终止消化。 6.吹悬： 轻轻吹打混匀， (倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形 )， 吹打成单细胞悬液后 按 1：2 或 1：3 比例传代接种于新培养皿。 再加入 10ml 全培。 （大盘10ml 全培，小盘 6ml 全培） （细胞生长快留 30%，慢 40%-50%；其余细胞可提取蛋白或 RNA ） 7.培养： 每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行 传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基 2300 μL/孔。 . 精品文档 2、 细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于 质粒的转染， 说明书 附后） 细胞接板 24 h 后转染。转染时细胞密度需达到 70-90%。 以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加 4ml全培。 取1.5 ml 离心管，加入 400 μL无血清无双抗 DMEM 培养液，加入质粒 2 μg， 混匀后静置 5 min，再转染试剂 4 μL，混匀（转染试剂是质粒的 2倍），室温 静置 15－20 min 。 ( 转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁 ; 静置时间不可超过 20 min ） 无血清无双抗 DMEM 量＝全培体积的 10％。如6孔板加 4mL培养液培养，即 转染体系为 400ul无血清无双抗 DMEM 。 缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。 转染后 6h后细胞换液，排除试剂的毒性影响。 24～48 h 后收集细胞用于后续实验。 Note ：如果用这种方法转染效率一直不佳， 可以在接种细胞前， 把转染试剂配好， 把转染试剂加到培养盘上， 再把细胞接种上。 该方法不适用所有细胞， 这种方法 会导致细胞死亡，不贴壁。 HiPerFect 转染试剂转染（用于 siRNA的转染， 说明书 附后） For transfe