基因工程的基本操作程序.pptVIP

学习文档 3.1.2.2.病毒介导的基因转移 (1)双链DNA病毒转化载体 这类病毒是以双链DNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV, Caullinus Mozic Virus）。 (2)单链DNA病毒转化载体 GeNV顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。 (3)单链RNA病毒转化载体 迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNA病毒为基因载体的基因转化体系，但是RNA病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒。 学习文档 病毒载体和质粒载体的比较 Ti质粒 病毒载体 导入寄主 转移过程复杂 简单 整合染色体 整合 不整合，防止无限代扩散 拷贝数 少 多 方便 不方便，需要器官组织转化 只要侵染即可 寄主 限制 范围广 学习文档 3.1.2.3 DNA直接导入法 3.1.2.3.1.物理方法 (1)基因枪法 80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。 该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。 首先将钨、金微粒(直径约0.4μm，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(1～2μl)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。 操作技术程序为： 学习文档 基因枪示意图 学习文档 基因枪所用材料： （1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。 （2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。 （3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。 基因枪法的特点：（1）转化效率高。 （2）受体广泛。 （3）操作简单。 学习文档 基因枪系统 学习文档 学习文档 (2)电激法(electroperation) 电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。 原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。 可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。 不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。 学习文档 操作程序： 将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0度下加高压（2～ 4KV），电脉冲10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60%～ 80%。 学习文档 (3)微注射法（micro-injection） 微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头—道进入。 真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。 显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。对于植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。常用的细胞固定方法有3种： 一、琼脂糖包埋法 二、多聚赖氨酸粘连法 三、吸管支持法 学习文档 (4)激光微束法(laser microbeam) (5)超声波法 此方法是利用直径很小、能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的外源DNA分子随之进入细胞。 基本原理：是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。 利用超声波处理可避免脉冲高压对细胞的损伤作用，有利于原生质体的存活，是一种有潜力的转化途径。 (6)离子束法 离了束作用在生物表面后可引起电子溅射，离子束的溅射好象一把手术刀，对生物体进行微细加工，使生物体表面层层剥离，原来不连通的通道在一定距离内连通，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上。 学习文档 3.1.2.3.2.化学方法 (1) PEG法 是细胞融合剂，它可以使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促使相互之间的接触和粘连；还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，从而有利于细胞膜之间的融合和外源DNA进入原生质体。 (2) 脂质体法