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GB4789.36-2016大肠埃希氏菌O157:H7/HM检验方法学验证报告
验证目的
验证《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/HM检验》在本实验室的适用性。
二、验证方法
样品采样方案依据GB4789.1-2010 《食品微生物学检验 总则》的要求进行,本实验样品取三个不同品牌典型样品进行实验,严格按照GB4789.36-2016进行。
表1:实验方法设计表
样品种类
样品名称
样品编号
实验人员
实验方法
蜜饯制品
xxx
xxx
a、b
双人双平行
熟肉制品
xxx
xxx
a、b
双人双平行
即食果蔬制品
xxx
xxx
a、b
双人双平行
除上述实验程序外,为保证本次验证的科学性和准确性,本次实验添加阴阳性对照,标准菌株大肠埃希氏菌(ATCC25922)做阳性对照,大肠埃希氏菌O157:H7(NCTC12900)做阴性对照,与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂
冰箱: SC-322 青岛海尔电器
生化培养箱:SPX-150B-Z 上海博迅实业
电位pH计:PHS-3C+(精确度0.01) 成都世纪方舟科技有限公司
恒温振荡器:SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂
菌落计数仪:Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司
天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司
三用紫外分析仪:ZF-2 上海安亭电子仪器厂
培养基和试剂:
改良EC(mEC+n)肉汤 北京陆桥技术股份有限公司
改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂 北京陆桥技术股份有限公司
三糖铁琼脂 北京陆桥技术股份有限公司
营养琼脂 北京陆桥技术股份有限公司
半固体琼脂 北京陆桥技术股份有限公司
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG(MUG-LST)北京陆桥技术股份有限公司
O157乳胶凝集试剂盒 广东环凯微生物科技有限公司
O157生化鉴定试剂盒 北京陆桥技术股份有限公司
四、验证环境
依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录;
依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜进行清洁消毒灭菌并记录;
依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及生物安全柜进行沉降菌检测并记录;
无菌室检验:详见《XXXX》;
五、验证步骤
1.操作步骤
1.1增菌
以无菌操作取检样25g (或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1min~2 min; 36℃±1℃ 培养18h~24h。
1. 2分离
取增菌后的mEC+n肉汤,划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上,36℃±1℃培养18h~24h,观察菌落形态。在CT-SMAC平板上,典型菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行判定。
1. 3初步生化试验
在 CT-SMAC 和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落,分别接种TSI 琼脂,同时接种MUG-LST肉汤,并用大肠埃希氏菌株( ATCC25922 或等效标准菌株)做阳性对照和大肠埃希氏菌O157 : H7 ( NCTC12900 或等效标准菌株)做阴性对照,于36℃±1℃培养18h~24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢( H 2 S )。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌O157 :H7 / NM 为 MUG 试验阴性,无荧光。挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于36℃±1℃培养18h~24h,并进行下列鉴定。
1. 4鉴定
1. 4. 1血清学试验
在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用O157乳胶凝集试剂作玻
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