大肠菌群MPN计数法方法学验证报告.docVIP

PAGE 3 GB 4789.3-2016大肠菌群MPN计数法方法学验证报告 验证目的 验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数（MPN计数法）》在本实验室的适用性。 二、验证方法 本实验样品取不同品牌或者同一品牌不同类型产品进行实验，严格按照GB4789.3-2010进行，本实验方法设计如下： 样品种类 样品名称 样品编号 实验人员 实验方法 蜂蜜 A XXXX a、c 双人双平行 蜂蜜 B XXXX b、a 双人双平行 蜂蜜 C XXXX c、b 双人双平行 除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。 三、验证设备和试剂 冰箱：BCD-212DG/A 海信（北京）电器 生化培养箱：LRH-70 上海一恒科学仪器 电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01） 成都世纪方舟科技有限公司 无菌均质器：SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司 恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂 菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司 天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司 超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业 培养基和试剂： 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 北京陆桥技术股份有限公司 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 北京陆桥技术股份有限公司 无菌 1 mol/L NaOH：同GB 4789.3项下制法。 无菌 1 mol/L HCl：同GB 4789.3项下制法。 无菌生理盐水：同GB 4789.3项下制法。 四、验证环境 依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录； 依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录； 依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录； 无菌室检验：详见《xxxx》； 五、验证步骤 样品的稀释 1.1 固体和半固体样品： 称取 25 g 样品放入盛有 225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。 1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。 1.3 样品匀液的 pH值应在 6.5～7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCl 调节。?1.4 用 1 mL微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1支 1 mL 无菌吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤和双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤阳性对照和空白对照各接种一管。36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环， 移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 管中，36℃±1 ℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g样品中大肠菌群的MPN值。 六、验证结果 实验结果如下表所示，详细实验结果见《食品中大肠菌群MPN计数检验原始记录（2010）》。 表1：大肠菌群MPN计数检验（2010）实验结果统计表 组别 样品名称 和编号 实验员 实验结果 平行