基因工程简答题.pdf

1.某学生在用 EcoRI切割外源 DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因并提出解 决的方案 ? （6 分） 答：(1) 导致星号活性因素： a 较高的甘油浓度 b 酶与底物 DNA 比例过高 （不同酶情况不同， 通常为＞ 100v/micHo.g ） c 低盐浓度 （25mM ） d 高 PH 值 （PH8.0） e 存在有机溶剂 （如 DMSO .乙醇（ 9）.乙烯乙二醇 .二甲基乙酰胺 .二甲基甲酰胺 .sulphalane(12) 等） f 用其他二价 离子代替 Mg2+(Mn2+.Cu2+.Co2+.Zn2+等) （2 ）抑制星号活性的方法： a 尽量用较少酶进行完全消化反应，这样可避免过度消化 及过度的甘油浓度 . B 尽量避免有机溶剂 （如制备 DNA 时二乙醇） 污染 c 将离子浓度提高到 100— 150mM （若酶活性不受离子浓度影响） d 将反应缓冲液 PH值降到 7.0 e 二价离子用 Mg2+ 3、目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？（ 10 分） 答： a. 目的基因的表达方式，细胞内表达或者分泌细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内 检测不到表达，或者表达很少 B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长 C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达 D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将你的产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得 产物的活性不高或者没有。 E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用偏好性不同导致不表达 . 4 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性 ? 答：蓝白斑筛选法出现假阳性的原因： β-半乳糖苷酶的 N 末端是非必须的， 可以进行修饰， 并不影响酶的活性或 α肽的互补性。如果插入的外源 DNA 引起 α肽的可读框的改变或者插 入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就形成白色噬菌斑。如果插入 DNA 的碱基数 正好是 3 的倍数，或者插入的 DNA 中不含有终止子的话，仍会形成蓝白菌落。这种插入物 的长度可达几百个碱基对 （1）蓝白斑筛选法原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基 因区外又另外引入了一段含有多种单一限制性酶切位点的 dna 序列，这些位点上如果没有克 隆外源性 dna 片段，在质粒导入 Lac 的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达， 与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入底物 X— gal 和诱导剂 IPTG 后出来蓝色菌落；如果在多克隆位点上插入外源基因，则使 LacZ’基因灭火，不能生 成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。 (2)假阳性的原因：不一定就是目的基因 5、当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施 ? 为什 么? （8 分） 答： 1.同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步，因为在非最 佳缓冲条件下时的切割速率会减缓 2 .分步酶切： 应从反应要求盐浓度低的酶开始， 酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶 的要求，然后加入第二种酶完成双酶切 3.使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切：在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些 特殊缓冲液中进行酶切， 这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。 由于内切酶在非 最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减慢，因此需要增加酶量或延长反应时间 6、用哪些方法可以检测转基因植物中的外源基因，如何检测？（ 8