凝胶层析法测蛋白质分子量.pdf

蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、 实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。 3. 了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。 二、 实验原理 （一） 蛋白质分子量的测定 蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 近年来已成为生命科学领域的研 究热点 [1] 。分子量是蛋白质的主要特征参数之一 , 当发现一种新的蛋白质时 , 首先应准确测定其分子量。 蛋白质分子量的测定方法有多种 , 如渗透压法、 光散 射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等 [2-4] 。 （二） 凝胶层析法 层析法，又称色层分析法或色谱法（ Chromatography ），在 1903-1906 年由 俄国植物学家 M.Tswett 首先提出。 虽然近年来质谱技术日益成熟 , 灵敏度、精确 度也为各种方法之首， 但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还 是凝胶层析等方法 [5] 。 凝胶层析法 （gel filtration ），又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法 (GPC ) 、 排阻色谱法、凝胶过滤色谱法 (GFC)、分子筛层析法（ molecular sieve chromatography ）等[6] ，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。 凝胶本身是一种分子筛， 可以把分子按不同大小进行分离， 如同过筛可以把 大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在 适宜的溶剂中浸泡， 使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中， 加入欲分离的混合物， 再以同一溶剂洗脱。 在洗脱过程中， 大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的 空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部， 流速缓慢，以致最后流出柱外， 从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 由于其分离条件温和、 样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等 特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中 最简单、条件最温和的方法， 且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。 虽 然其分离效果不及高效液相色谱， 但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化 达到更好的效果 [7] 。 （三） 凝胶 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔 网状结构。常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（ agarose gel ，商品名 Sepharose ），人工合成凝胶是葡聚糖（ dextran ，商品名为 SePhadex ）， 凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小 有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应 的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大， 适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 （四） 测量方法 凝胶过滤层析 , 是一种分离不同大小分子的分配层析 , 被分离物 质的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配 , 混合物随流动相流 经层析柱时 , 各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动 , 混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离 , 这种方法操作简 便 , 费用较低 , 重复性好 [8]