新冠核酸检测扩增检测操作规程（达安绿盒）.doc

SOP_18-35 新型冠状病毒2019-nCoV基因 （达安）扩增检测操作规程 1.名称 新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA 2.目的 规范新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。 3.方法 TaqMan探针实时荧光定性。 4.检测原理 基于一步法RT-PCR技术，选取2019新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab和N基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针（N基因探针采用FAM标记，ORF1ab探针采用Yellow标记）用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测；同时包括内源性内标检测系统（内标基因探针采用Cy5标记），用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。 5.样品 咽拭子、痰液等 6.试剂 中山大学达安基因股份有限公司 组分名称 规格 数量 主要成分 PCR检测试剂 （大包装，96人份/盒） NC(ORF1ab/N)PCR反应液A 900ul/管 2 特异性引物、探针、三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液 NC(ORF1ab/N)PCR反应液B 200ul/管 2 热启动Tap酶、c-MMLV酶 NC(ORF1ab/N) 阴性质控品 400ul/管 1 含内标片段的假病毒 NC(ORF1ab/N) 阳性质控品 400ul/管 1 含目的片段的假病毒、含内标片段的假病毒 7.仪器 苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量 PCR 仪。 8.操作步骤 8.1 PCR试剂准备（I区） 8.1.1从试剂盒中取出NC(ORF1ab/N)PCR反应液A、NC(ORF1ab/N)PCR反应液B，室温融化后振荡混匀，掌上离心机离心10秒后使用。 8.1.2取N个（N＝待测样本个数+NC(ORF1ab/N)阴性质控品+NC(ORF1ab/N)阳性质控品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区～II区传递窗。 NC单人份扩增体系配制如下表： NC(ORF1ab/N)PCR反应液A NC(ORF1ab/N)PCR反应液B 扩增体系 17ul 3ul 20ul 8.1.3 每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。 8.2核酸模板提取（II区） 核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。 8.3加样（II区） 在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控品、弱阳性质控品各5ul，盖紧管盖，6,000rpm离心数秒后，置II区～III区传递窗。 8.4PCR扩增检测（III区） 8.4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。 8.4.2循环参数设定： 序号 步骤 温度 时间 循环数 1 反转录反应 50? 15分钟 循环1次 2 预变性 95? 15分钟 循环1次 3 变性 94 15秒 循环45次 退火、延伸及检测荧光 55? 45秒 8.4.3样品设置 在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。 9.结果分析 选择定性分析模式，自动调整阈值，必要时可手工设定，以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情况进行调整。 10.质控标准 10.1 NC(ORF1ab/N)阴性质控品：FAM和VIC检测通道无明显扩增曲线，Cy5通道有明显扩增曲线。 10.2 NC(ORF1ab/N)阳性质控品：FAM和VIC检测通道有明显扩增曲线，Ct值≤32，Cy5通道有或无扩增曲线。 10.3应同时满足上述2项条件，否则试验无效。 10.4每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性混合样本）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。 11.结果判断 11.1如果检测样品在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值＞40，且Cy5通道有扩增曲线，可判样品未检测到2019新型冠状病毒(2019-nCoV)RNA阴性。 11.2如果检测样品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明显的扩增曲线，可判样品为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)阳性。 11.3如果检测样品在FAM或VIC单一通道Ct值≤40，另一通道无扩增曲线，结果需复检，复检结果一致可判读为2019新型冠状病毒(