新冠核酸检测扩增检测操作规程SOP(达安红盒).doc

SOP_18-35 新型冠状病毒2019-nCoV基因 （达安红盒）扩增检测操作规程 1.名称 新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法） 2.目的 规范新型冠状病毒（2019-nCoV）RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。 3.方法 TaqMan探针实时荧光定性。 4.检测原理 基于一步法RT-PCR技术，选取2019新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab和N基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针（N基因探针采用FAM标记，ORF1ab探针采用VIC标记）用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测；同时包括内源性内标检测系统（内标基因探针采用Cy5标记），用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。 5.样品 咽拭子、痰液等 6.试剂 中山大学达安基因股份有限公司 组分名称 规格 数量 主要成分 PCR检测试剂 （大包装，96人份/盒） 2019-nCoV PCR 反应液 A 918μL/管 2 特异性引物、探针、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 2019-nCoV PCR 反应液 B 204μL/管 2 热启动 Taq 抗体酶、Taq 酶、C-MMLV 酶、dNTPs、UDG酶、RNasin 2019-nCoV 阴性质控品 450μL/管 2 含 2019-nCoV 内标片段（RNase P 基因）的假病毒、TE NC(ORF1ab/N) 阳性质控品 400ul/管 2 含 2019-nCoV 目的片段的假病毒、含 2019-nCoV 内标片段（RNase P 基因）的假病毒、TE 7.仪器 苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量 PCR 仪。 8.操作步骤 8.1 PCR试剂准备（I区） 8.1.1从试剂盒中取出2019-nCoV PCR 反应液 A、2019-nCoV PCR 反应液 B ，室温融化后振荡混匀，掌上离心机离心10秒后使用。 8.1.2取N个（N＝待测样本个数+NC(ORF1ab/N)阴性质控品+NC(ORF1ab/N)阳性质控品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区～II区传递窗。 NC单人份扩增体系配制如下表： 2019-nCoV PCR 反应液 A 2019-nCoV PCR 反应液 B 扩增体系 17ul 3ul 20ul 8.1.3 每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。 8.2核酸模板提取（II区） 核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。 8.3加样（II区） 在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控品、弱阳性质控品各5ul，盖紧管盖，6,000rpm离心数秒后，置II区～III区传递窗。 标本制备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mg/L含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。 8.4PCR扩增检测（III区） 8.4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。 8.4.2循环参数设定： 序号 步骤 温度 时间 循环数 1 反转录反应 50? 2分钟 循环1次 2 预变性 95? 2分钟 循环1次 3 变性 95 5秒 循环10次 退火、延伸 60? 35秒 4 变性 95 5秒 循环32次 退火、延伸及检测荧光 60? 35秒 8.4.3样品设置 在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。 9.结果分析 选择定性分析模式，自动调整阈值，必要时可手工设定，以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情况进行调整。 10.质控标准 10.1 2019-nCoV 阴性质控品：FAM 和 VIC 检测通道无Ct值或无明显扩增曲线， Cy5通道 Ct≤25； 10.2 2019-nCoV 阳性质控品：FAM 和 VIC 检测通道 Ct 值≤22； 10.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。 10.4每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性混合样本）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，