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成骨细胞茜素红染色方法改进 成骨细胞茜素红染色方法改进 ２０１２年第期籍熬 成骨细胞茜素红染色方法改进 （苏州大学骨科研究所，江苏苏州２１５００７） 摘要目的：优化茜素红染色方法，应用于干细胞成骨分化检测。方法：干细胞成骨诱导分化后，ｖＹ，７０％乙醇进行细胞固定，以ｐＨ值为８．３的ＰＢｓ和Ｔ矗ｓ—Ｈｃｌ以及ｐＨ值为４．２的ＰＢｓ和Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ配帝］茜素红溶液，进行成骨细胞染色。结果：不论是ＰＢＳＪ丕是＿Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ，ｐＨ值为８．３的较难染色，而ｐＨ值为４．２则可成功染色。结论：茜素红溶液的ｐＨ值调整为４．２有利于成骨细胞染色。关ｔ词成骨细胞；固定液；茜素红溶液；ｐＨ值中圈分类号Ｒ１５３ 文章编号１６７３—９６７１一（２０１２）１２２—０１７４—０１ 成骨分化是干细胞的一个重要特性。在特定的诱导培养基作用一段时间后，干细胞可分化为成骨细胞，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。应用茜素红溶液对成骨细胞染色，茜素红可与钙离子螯合，产生红色或紫红色的复合物，可用于鉴定干细胞是否已成功向成骨细胞分化。１材料与方法１．１药品与试剂 ５－７Ｙ］龄的新西兰大白兔由苏州大学南校区动物房获得。 ＤＭＥＭ—ＬＧ培养基、胎牛血清ＦＢＳ、青一链霉素，购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司。 胰酶，购自Ｇｉｂｃ＃公司。 成骨分化试剂，包括地塞米松、Ｂ一甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐：茜素红，均购自Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司。 １－２兔骨髓问充质干细胞的提取 ＤＨ值为８．３的ＰＢＳ溶液配制的茜素红无法成功染色 从５～７Ｂ龄的新西兰大白兔中取出股骨和胫骨，放人含１００Ｕ／ｍ１青霉素和１００斗ｇ／ｍＬ链霉素的ＤＭＥＭ—ＬＧ培养基中。在超净台中，将骨表面组织剃除干净，以ＰＢＳ冲洗。将骨骺最外端切开，以培养基将骨髓冲洗出来。骨髓液以１０００ｒｐｍ离心，计数后以含１０％胎牛血清和１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００斗ｇ／ｍＬｔ琏霉素的ＤＭＥＭ—ＬＧ培养基重悬细胞沉淀，接种在培养皿中，在３７。Ｃ、５％Ｃ０２的条件下培养。每２天换一次液。细胞在原代和传代培养后贴壁生长。红细胞和其他未贴壁的细胞则在换液时被移除２。１．３成骨诱导分化 将第２代骨髓间充质干细胞以２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２密度接种于２４孔板内，以基础培养基（ＤＭＥＭ—ＬＧ培养基，含１０％胎牛血清和１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００“ｇ／ｍＬ链霉素）进行培养。待细胞长至约８０％时，以成骨诱导分化培养基（基础培养基，添加ｏ．１¨Ｍ地塞米松、０．２ｍＭ抗坏血酸磷酸盐和１０ｍＭＢ一甘油磷酸钠）进行诱导，诱导时间为２ｌ天。 １．４配制茜素红染色液 分别以ＰＢＳ或Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ配制０．１％茜素红溶液，其ｐＨ值均调为 ８．３或４．２。 将固定好的细胞１）．２ｐＨ值为８．３的ＰＢＳ溶液配制的茜素红染色３０ｍｉｎ后观察，肉眼下看，细胞层几乎无色。置于显微镜下观察，细胞表面呈淡淡的粉色，并非明显的红色或紫红色。将染色时间延长至ｌｈ或染色过夜，结果仍然显示未成功染色。 ２．２ｐＨ值为８．３的Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ溶液配制的茜素红无法成功染色 操作同２．１。结果同样显示，不论染色时间多久，细胞仍然呈现较浅的颜色，未染色成功。 ２．３ｐＨ值为４．２的茜素红溶液可成功染色 细胞固定后ＩＪ．２ｐＨ值为４．２的茜素红溶液染色，结果表明，不论是以ＰＢＳ或Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ为溶剂，在３０ｍｉｎ内，茜素菜红溶液可成功将诱导的成骨细胞染色。细胞在肉眼观察下即可发现呈明显的紫红色，在显微镜下可看见明显的紫红色钙结节，细胞亦被染成紫红色。３讨论 以茜素红溶液染色是鉴定间充质干细胞向成骨细胞分化的一个重要方法。间充质干细胞在成骨分化的过程中，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。茜素红与钙离子螯合可形成紫红色或红色复合物。而在正常培养条件下，钙盐作为难溶盐，不以钙离子存在。故在茜素红溶液ｐＨ值为８．３的条件下，钙结节无法被染色。而当茜素红溶液ｐＨ值被调节为４．２时，钙盐可解离出大量钙离子，从而与茜素红螯合形成复合物，可在显微镜下检测出。因此，茜素红溶液的ｐＨ值对于成骨细胞的成功染色至关重要。 【１］ｚｈａｎｇｊ，ＷａｎｇＪＨ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ／ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｒａｂｂｉｔｔｅｎｄｏｎ ｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｔｅｎｏｃｙｔｅｓ．ＢＭＣＭｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔＤｉｓｏｒｄ２０１０；１１：１０． 【２］何志义，原丽英，陈晏，赵晶，邹巧治，高卓，欧阳嶷．大鼠骨髓基质细胞的体外分离、培养和鉴定的实验研究【Ｊ】．中国医科大学学报，２００