丹参素对糖皮质性骨质疏松症的影响研究.pdf

第 3 章 丹参素对青年大鼠峰值骨量的影响研究 丹参素 (DSS)是一种水溶性酚性芳香酸类化合物,主要来源于唇形 物丹参和甘西鼠尾草的根，始载于《神农本草经》。丹参素是一种天然活 性产物且具有清除氧自由基、降解过氧化物及抗氧化特性,其抗氧化活性 强于维生素 C。 目前对OP 防治的研究有增加BMD 和改善骨质量两个方面，而检测骨 质量变化最直观的方法之一便是骨形态计量学分析，检测结果对 OP 具有 特殊的价值和意义。骨组织形态计量学是生物医学组织中形态计量学和 体视学的一个分支，是依据骨组织的生理结构，以视觉原理为基础，通 过目标图像的分析测量来计算实验数据，获得骨组织微结构的相关参 数。其与 BMD 检测技术相比，骨形态计量学分析除了定性分析骨组织形 态变化情况外，还可以对皮质骨的厚度和孔隙率、骨小梁面积与宽度和 新骨组织生长速率等骨的微结构特征进行定量分析，从客观上衡量骨组 织的生理学特性。虽然骨组织形态计量学有诸多的优点，但其也具有准 备工作繁琐、制作过程对样本造成破坏、影响后续研究等缺点。而且传 统的静态二维测量忽视了骨小梁各项特异性特征，基于二维参数推导出 的三维结构也很难真实的反映骨的微观结构。随着针对无损材料检测和 三维微聚焦计算机断层扫描摄影技术（Micro-CT，μCT或者显微CT）的 出现，为骨微结构的三维分析和定量计算提供了更方便的检测方法和更 精确的测量结果[77,78]。所以，二维分析结合Micro-CT 分析将更为准确的 表述骨组织的形态，为 OP 骨组织研究提供更加准确的结果。 1 材料与方法 1.1 实验动物 5 月龄雌性 SPF 级 wistar 大鼠 30 只，体重为(300±20)g，由中国人 民解放军兰州总医院动物实验科提供，动物检验合格证编号： SYXK(军)2012-0029。饲养室温度(22±2)℃，湿度为(55±5)％，不限制 饮食饮水，饮用水为纯净水，SPF 级大鼠饲料喂养，普通饲养笼中饲养。 1.2 试剂与仪器 丹参素（上海麦克林生化科技有限公司）；水合氯醛（北京通县育才 精细化工厂）双能 X 线骨密度仪（美国 GE）公司；AG-IS 型电子万能试 验机（日本岛津公司）；炔雌醇 (中国食品药品检定研究院,ID:GAJ7- N8RF,纯度≥99.5％)，LD4-2A 低速离心机 (中国，北京医用离心厂)，酶 标仪（美国 BioTek 公司）；骨钙素试剂盒（英国 IDS）公司。SP1600 硬 组织切片机（德国，LEICA 公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒 （英国IDS）公司 1.3 实验分组及处理 将30只大鼠随机分为三组，空白对照组、雌二醇组、丹参素组，每组 10只，编号后记录体重。雌二醇组采用雌二醇灌胃，灌胃浓度为 -1. -1 0.21mg/ka;丹参素组采用丹参素灌胃 (12.5mg.kg d )；空白对照组采用 蒸馏水灌胃，调整灌胃体积与丹参素组等量，每周一测定员次体重，每 周的灌药量根据周一体重做相应调整，灌胃时间为早上10：00-10：30。 1.4 骨密度检测 分别在灌胃 4、8、12 周后，用 10％的水合氯醛以3.5ml/kg 的剂量 腹腔注射麻醉后置 于双能 X 线骨密度仪测量大鼠全身骨密度；12 周后处死，将大鼠左 侧股骨和腰椎分离，测定离体骨密度。 1.5 生物力学指标， 将大鼠右侧股骨分离，置于万能力学实验机进行三点弯曲试验，跨 距设置为 15mm，加载速度为 2mm/min,测定最大载荷 (N)和弹性模量 2 （N/mm ）、屈服强度（N）和断裂点载荷（N）。取第4 腰椎，剔除多余的 软组织，修剪为近似圆柱体，加载速度为 2mm/min, 测定最大载荷和弹性 模量。 1.6 血清生化指标检测 用采血针抽取大鼠腹腔静脉血液，置于离心机 4000r/min 离心机 20min 取上清-80℃保存；ELISA 试剂盒测定血清 TRAP-5b、OC 水平，按 说明书绘制标准曲线，于酶标仪 405nm 和 450nm 处测定吸光度值，计算 其含量。 1.7 骨形态计量学分析 将大鼠处死，将分离出来的右侧胫骨保存于 70％的乙醇中，不脱钙 塑料包埋法包埋，硬组织切片机切，用砂纸膜片，后行苏木素碱性品红-