第二章DNA重组克隆的单元操作酶.pptx

第二节 工具酶 ;;（一）基本知识;;RE将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。;细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。;3.性质:内切酶,在核酸分子链的内部制造切口的酶。;4.功能:自我保护作用;I 型限制性内切酶 ;首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。;（2）识别位点序列;需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。;类型Ⅰ：大型的多亚基的蛋白质。 具有内切酶的活性、 具有甲基活性化酶的活性。 具限制和修饰两??体系， 切割位点基本上是随机。 因此Ⅰ型内切酶在DNA重组研究工作中并没有什实际用处。 ;首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。;（2）识别位点序列;EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端;（4）粘性末端;;①连接便利;;③ 补平成平齐末端;识别位点和切点完全相同称同裂酶。 ;Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’ 3’-GGG?CCC-5’ ; ;;（6）II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作;II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：;对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：;3. III类限制性内切酶 ;;1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：;4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。;限制性核酸内切酶的命名;DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。;大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：; 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响。;不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。;是影响限制酶活性的重要因素。;温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。;EcoR I和BamH I等都有*活性。;Eco R I 在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。 ;（五）限制性内切酶对DNA的消化;内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。;只有有限数量的酶切位点被切开。;大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。;（一） 功能：; 在大肠杆菌中大多数都有如下位点特异的甲基化酶。;（三） 甲基化对限制酶切的影响;三、 DNA连接酶(DNA ligase);OH P;2、种类;1) 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。;2) 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键;;Tris-HCl;（1）必须是两条双链DNA。 不能催化两单链DNA分子连接； 只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能 连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺(gap)。;DNA ligase 的活性;（2）DNA3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。;连接酶反应的最佳温度是37?C。;;（一）基因工程中常用的DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 噬菌体DNA聚合酶 4. T7 噬菌体DNA聚合酶 5. 耐热DNA聚合酶 6. 反转录酶 7.末端转移酶;1. 共同特点;（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途;;标记;标记;③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记;5’?3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。;纯化的DNA片段;2. Klenow fragment;① 3’端补平;;③ cDNA第二链的合成;（1） T4 DNA聚合酶的性质;③ 特点;;（2） T4 DNA聚合酶的用途;酶切中间产生两个末端标记;4. T7 DNA聚合酶;（2）T7 DNA聚合酶的特点;② 进行末端标记 ;5.