分子诊断学：核酸序列分析.pptx

核酸序列分析; 核酸是生物遗传的物质基础，核酸分脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）两类，核酸的一级结构是指核苷酸的排列顺序，由于核苷酸间的差异主要是碱基的不同，因此也称为碱基序列。; RNA与DNA的差别是嘧啶成分为胞嘧啶和尿嘧啶而不含胸腺嘧啶。核酸由磷酸二酯键连接形成多聚核苷酸，核苷酸的连接具有严格的方向性，前一位核苷酸的3′-OH与下一位核苷酸的5′磷酸间形成3′，5′磷酸二酯键，构成一个没有分支的线性大分子，其两个末端分别称为3′末端和5′末端。; DNA和RNA对遗传信息的携带和传递就是依靠核苷酸中的碱基排列顺序不同来实现的。可见测定和分析核酸序列对于了解生物个体的千差万别，对于人类各种疾病的诊断和治疗是十分重要的。 ; 在进行核酸测序之前，应该根据测序的目的，待测核酸片段的大小，测序的精确度，待测核酸片段的数量和质量，以及实验室的设备、仪器等条件制定一个总体的测序策略。 ;比较常用的方法有以下3种： 1.随机法：又称鸟枪法。将待测DNA用酶切或超声波随机切割成长短适宜末端又相互有重叠的小片段。长链DNA片段在超声波处理前，最好预先环化。在超声波处理时，环化的DNA片段被打断的随机性好，可以产生一组相互重叠的DNA小片段。; 用核酸酶I随机切割待测DNA，可以产生一组相互重叠的DNA小片段，用聚丙烯凝胶电泳分离这些DNA片段，回收大小600个 碱基左右的适合测序的DNA片段。用DNA聚合酶修补其末端，与载体重组，形成亚克隆。亚克隆扩增后，再对其克隆片段进行测序。并将所得资料输入计算机，通过计算机处理最终可以获得待测DNA全序列。; 一般随机测序，真正要测的序列通常会比待测DNA实际序列多4到6倍。因为在大多数情况下，要到90%左右的序列测出来之后，才能得到单一的能够连在一起的一段序列。由于有些小片段会多次出现，而另一些小片段又可能未出现。这种结果在所难免，因此采用随机法对大片段DNA测序，其结果可能会不太完整。;2.渐进法：将待测大片段DNA克隆于载体，利用通用引物测定DNA片段两端序列，然后根据已测出的核酸序列???计引物，向前继续测序，逐渐获得待测DNA全序列。该方法的优点是构建亚克隆及整个测序过程，可以是逐步推进的方式进行。缺点是要合成许多引物，另外如果待测DNA中有多次重复序列时，会影响测序结果。;3.嵌套缺失法：用2种不同的限制性核酸内切酶将待测DNA片段的重组体切断，其中一端可以产生平端，而另一端可以产生3′突出端。核酸外切酶Ⅲ可以催化从平端逐一切除5′单核苷酸，而对3′突出端没有活性。用S1核酸酶及DNA聚合酶对已消化的DNA进行修补，再用DNA连接酶重新形成环化重组体，这样就可以得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆。将各个克隆用于测序，从各个片段的缺失端开始测序，测序采用同一引物，测定结果从亚片段序列相互重叠的部分可以将相邻片段的序列彼此拼接，这样通过综合嵌套就可以测出大片段DNA序列。; DNA链末端终止法也称为Sanger法。1977年由分子生物学家F.Sanger发明。这是一种简单快速的DNA测序方法。它的基本原理是利用4种2′，3′-双脱氧核苷酸（ddNTP）取代脱氧核苷酸(dNTP）作为底物进行DNA合成，由于ddNTP没有3′-OH基团，不能与下一个核苷酸反应形成磷酸而酯键，DNA合成反应就会终止。;;; 测定反应分为4组，在每一反应管中加入待测DNA模板、引物DNA聚合酶，用32P或35S标记的一种dNTP，反应适当时间后，每一反应管中分别加入4种ddNTP的一种，反应产物是不同长度的DNA片段，他们具有相同的5′末端，而3′末端的ddNTP取代处终止。经聚丙烯凝胶电泳分离，发射自显影就可以测出一段DNA序列来。;链末端终止法测序主要实验步骤： 1.引物合成： 商品合成的多为通用引物，一般为20个碱基左右长度的核苷酸多聚体。为了便于保存和运输，引物多为冻干粉剂，使用时需用TE(10mmol/L Tris·Cl,1 mmol/L EDTA,pH7.4)溶解成2μg/ml的浓度。实验室也可以根据自己的需用合成引物，实验室合成的引物也应溶解成2μg/ml的浓度并贮存于-20℃。;2.M13载体系统及测序DNA载体的制备： M13噬菌体有mp18和mp19两个载体，分别含13个不同的多功能酶切位点，可以作为外源DNA插入区域。在细菌体内M13是双链形式，可以克隆载体。在细菌体外以单链形式存在，可作为测序模板。M13载体系统插入了β-半乳糖苷酶基因的调控序列及N端146