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原生质体培养与融合 原生质体培养与融合 植物原生质体培养 ?原生质体培养发展简史及其意义?原生质体分离及培养 ?原生质体融合 原生质体（Protoplast）?1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。 ?含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活 力的裸露细胞。 植物细胞模式图 质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁 细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5% 一、原生质体培养发展简史及其意义 ?1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；?1960年：1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体； ?1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场； ?1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。 ?1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。 1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水黄瓜、杨树、云杉等； ?1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功； 2、原生质体培养的意义 （1）为细胞融合奠定基础。 有性杂交不能进行细胞质交流。 （2）是遗传工程的理想受体。 能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。 （3）理论研究 细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。（因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。）但是必须指出： 原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。 二、原生质体分离及培养 （一）分离方法 （二）原生质体纯化 （三）原生质体活力测定 （四）原生质体培养 （五）原生质体再生 （一）分离方法 ?机械法：利刃机械切割 ?酶解法：果胶酶和纤维素酶处理 1、机械分离Machanical isolation 高度液泡化的细胞 Enzymatic isolation2-1 材料 获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂，因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料。双子叶外植体/ 培养细胞。单子叶植物胚性细胞。 2-3 酶液渗透压 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入。 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统 2-4 材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。 2-7 原生质体分离过程（以烟草叶片为例） 一．预处理即对烟草植株限制供水。 二．取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表 皮切成4cm的小块。 三．制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5%） 并加入的0.7 mol甘露醇，0.1 mmolCaCl2，pH5.6。 四．将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理8~10小时。 五．过滤、离心、洗涤（0.7 mol甘露醇液含0.1 mmolCaCl2）。如此2~3次、得到原生质体。 （二）原生质体纯化 ?酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。 ?原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法三种。 1、离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。 ?第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。?第二步离心（500~1000r/min离心 5~6min）。 ?第三步吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。?第四步用原生质体培养液洗1次，收集原 原生质体分离纯化流程图 ?原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 ?洗涤液：3%蔗糖+0.4mol/L甘露醇+1480mg/LCaCl22H2O 或11%~23%的蔗糖溶液。 （三）原生质体活力测定孢质环流法