生物化学课件第五章蛋白质的共价结构.pptx

第五章蛋白质的共价结构 蛋白质结构层次蛋白质的结构层次 1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构：氨基酸序列 secondary structure 二级结构：α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。 肽基的C、O和N原子间的共振相互作用sp2sp3sp2sp2共振杂化体共振产生的重要结果：?限制绕肽键的自由旋转 ?形成酰胺平面 ?产生键的平均化 ?肽键呈反式构型历史上第一个被确定氨基酸序列的蛋白质胰岛素insulin胰岛素的历史 第一个生化药物最小的蛋白质，由A链(21 AA)和B (30 AA)组成；动物胰腺?细胞分泌的一种激素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；1921年Banting Best 从胰腺中抽提出了有活性的胰岛素，1923年Banting Macleod获Nobel医学奖；1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得Nobel化学奖；1981年，Berg（因DNA重组技术得奖）在大肠杆菌中表达了人胰岛素.蛋白质一级结构测定步骤一级结构测定策略蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化 2、测定蛋白质分子中多肽链的数目3、亚基分离4、二硫键的拆分与保护5、分析每一多肽链的氨基酸组成6、鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基7 、多种方法的部分水解8、测序 9、重叠 10 、二硫键位置的确定N端的测定方法1、Sanger（二硝基氟苯）法2、丹磺酰氯法3、Edman法4、酶降解法弱碱中DNP-AA(黄色)氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）+氨基酸DNFB（dinitrofiuorobenzene）+ HFSanger试剂标记反应Sanger试剂(FDNB)标记N末端Sanger试剂标记测序ABCDE↓*ABCDE↓*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE↓*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E↓*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：A B C D EFDNB部分水解完全水解FDNBCH3CH3CH3CH3NNHN—CH—COOH H2N—CH—COOH +pH9.7 40℃ R RO=S=OO=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）DNS-氨基酸酰化反应取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高弱硷中(400 C)(硝基甲烷 400 C)H+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）+PITC（phenylisothiocyanate）Edman降解法1Edman 降解法(I)DABITC ：有色Edman试剂在Edman试剂上加发色基团Edman降解法2Edman 降解法(II)无冕英雄Pehr Victor Edman 瑞典人, 1916.4.14-1977.3.191946-47年在美国留学时想到改进1930 年Abderhalden Brockmann发明的 PITC试剂的反应, 50年发明Edman degradation反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950) 1957年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始 过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸的速度; 他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开发仪器的方便. 1972年到德国,77年因脑瘤过世.由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测, 只有HPLC和相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是Edman没有和他们分享Nobel化学奖.C端的测定方法1、肼法2、还原法3、酶降解法 肼法C端测定肼(hydrazine)法测定蛋白质与无水肼加热 -------NH-CH-CONH-CH-COOH | | Rx Ry -- + -- + NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH | | Rx Ry＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有机溶剂而被除去多种方法确定酶解法末端测序酶解法末端测序 利用外切蛋白水解酶 (exo-peptidase)