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小球藻的玻璃化超低温保存法 小球藻的玻璃化超低温保存法 植物生理学通讯　　第４０卷　第５期，２００４年１０月599 小球藻的玻璃化超低温保存法 蔡小宁＊　　陈舒泛　　陈俊　　刘少华 南京晓庄学院生命科学系，南京　２１００１７ Cryopreservation of Chlorella vulgaris by Vitrification CAI Xiao-Ning*, CHEN Shu-Fan, CHEN Jun, LIU Shao-Hua Department of Life Science, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 210017 提要　　先用含０．５　ｍｏｌ·L－１甘油和０．４　ｍｏｌ·L－１蔗糖的预处理液处理２０　ｍｉｎ，　然后用含３０％蔗糖＋１５％乙二醇＋１０％二甲基亚砜＋ＢＢＭＧ培养液的玻璃化液处理，在０℃下预冻６０　ｍｉｎ后，将小球藻投入液氮。此法存活率较高，可达到６０．１４％，小球藻种质保存效果较好。通过试验初步建立了小球藻玻璃化法超低温保存的技术程序。关键词　　小球藻；　超低温保存； １０年来，随着超低温保存技术的建立和发展，有多种植物的细胞、组织和器官实现了超低温冰冻保存［１］。玻璃化保存法是近年来发展起来的一种保存方法，与其他超低温保存方法相比，具有设备简单、程序简化和冻存效果好等优点，在植物上已经取得很大进展［２，３］。目前，藻类种质的超低温保存技术已受到广泛的重视。迄今为止，绝大多数藻类是采用两步冰冻法保存［４￣７］，采用玻璃化法超低温保存藻类的报道很少［８］。本文探讨玻璃化法超低温保存小球藻种质的技术。离心（转速５００　ｒ·mｉｎ－１，下同），弃去上清液，小球藻沉降于离心管底部，然后分别加入预先配制的不同浓度的预处理液（表１），混匀，于室温下处理２０　ｍｉｎ后再离心。３　　玻璃化液处理 玻璃化液配方为３０％蔗糖＋１５％乙二醇＋不同浓度二甲基亚砜＋ＢＢＭＧ培养液，加入前先放在０￣４℃下预冷，在无菌条件下取代预处理液，悬浮后移入冻存管，于０℃下预冻不同时间后放入液氮中。 ４　　化冻和玻璃化保护剂的去除 将在液氮中保存半年后的冻存管取出，立刻放入４０℃恒温水浴中迅速摇动，直到最后一个冰晶消失后移入室温中。化冻后的小球藻在无菌条件下先在０．４　ｍｏｌ稬－１的蔗糖溶液中室温平衡５　ｍｉｎ，然后再在１．２　ｍｏｌ稬－１蔗糖溶液中平衡５　ｍｉｎ，最后转入ＢＢＭＧ液体培养基中培养。培养条件为２７℃、弱光、摇床速度１２０　ｒ·mｉｎ－１，培养４　ｄ。５　　存活率的测定 参照Ｃａｎａｖａｔｅ及Ｌｕｂｉａｎ的方法［１０］，将经过处理的小球藻样品和对照小球藻样品再培养４　ｄ后，用７２２型光栅分光光度计于波长５４０　ｎｍ处测藻液的吸光度。根据预先确定的藻细胞密度（ｙ×1０８ １　　实验用小球藻的准备 小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）接种前，所用的液体培养基和容器于１．２　ｋｇ·cｍ－２压力下蒸汽灭菌２０ｍｉｎ。从保存藻种的平板上挑取小球藻，培养于装有５　ｍＬ　ＢＢＭＧ液体培养基（参照　Ｂｏｌｄ’s　ｂａｓａｌ　培养基配方［９］，其中含７５　ｇ稬－１硝酸钠、　１０　ｇ稬－１葡萄糖、１０　ｇ稬－１蛋白胨）的试管中。弱光下（根据我们的试验，在异养培养条件下光照强度对小球藻生长无影响）培养５￣７　ｄ，再将试管种接入５０　ｍＬＢＢＭＧ液体培养基，于弱光下培养至对数期，此为最初的液体种子。培养小球藻时，接入２％的液体种子于５０　ｍＬ培养液中，放在摇床上于２５℃弱光下培养，摇床转速为１２０　ｒ·mｉｎ－１，４￣５　ｄ即可得到实验用的小球藻。２　　预处理液的加入 在室温下分别取２　ｍＬ藻液置于若干离心管中 600植物生理学通讯　　第４０卷　第５期，２００４年１０月 个·L－１）和吸光度（ｘ）的直线回归方程：ｙ＝３．４５６ｘ－０．３８９（ｒ＝０．９９６１），可以推算出上述冰冻样品和对照样品在再培养４　ｄ后的藻细胞密度，两者的百分比值即为超低温保存的存活率［６］。 实验重复３次，每处理设置３个平行样品，取平均值。 成［１１］。甘油也是一种常用的冰冻保护剂。我们比较了预处理液中甘油和蔗糖的浓度及组合对玻璃化法超低温保存小球藻存活率的影响，结果（表１）表明，在所试浓度范围内，如果预处理液中不添加甘油和蔗糖，而仅仅作玻璃化液处理的存活率最低，为２９．１１％；预处理液中单加甘油或蔗糖的存活率大幅度提高；预处理液中甘油和蔗糖都添加时，小球藻的存活率则随着甘油浓度的增加而逐渐下降。这表明，玻璃化液处理前，先用含有蔗糖和甘油的预处理液预