灰绿黄堇总生物碱对实验性溃疡性结肠炎的作用研究灰绿.docx

PAGE PAGE 1 灰绿黄堇总生物碱对实验性溃疡性结肠炎的作用研究灰绿 　　 　　【摘要】 目的 研究灰绿黄堇总生物碱(ACAM)对小鼠结肠炎的作用及其机制。方法 实验设正常、模型、柳氮磺胺吡啶组(SASP，520 mg/kg)和ACAM组(100、200、400 mg/kg)。正常组小鼠饮用蒸馏水，其余组自由饮用4%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液，同时分别灌胃给予溶剂或干预药物(0．2 ml/10 g,1次/d×7 d)。记录小鼠疾病活动指数(DAI)；测定结肠组织MDA含量，SOD、MPO活性及ICAM-1、NF-κB p65表达水平。结果 模型组DAI显著增高，结肠黏膜损伤严重；MDA舍量、MPO活性及ICAM-1和NF-κB p65表达明显升高。SOD活性下降(P[1]。它是一种具有较好的消炎、利胆、排石、止痛作用的草药[2]。王继生等[3]对其灰绿黄堇的水提物进行研究，发现灰绿黄堇的水提取物具有明显的镇痛、抗炎作用。作者对灰绿黄堇水提物镇痛抗炎的有效部位进行筛选，发现灰绿黄堇水提物镇痛抗炎的有效部位为灰绿黄堇总生物碱(the crude alkaloids of corydalis adunca maxim,ACAM)[4]，同时发现灰绿黄堇总生物碱对实验性溃疡性结肠炎有很好疗效，本实验采用小鼠实验性溃疡性结肠炎模型观察ACAM的药效学及其作用机制，现报道如下。? 　　1 材料与方法? 　　1．1 材料 清洁级BALB/c小鼠，雌雄兼用，体质量(20±2)g，由重庆医科大学实验动物中心提供；ACAM由重庆医科大学化学教研室提供(纯度大于95%)。DSS由Sigma公司(美国)提供；SASP由浙江九州药业股份有限公司提供；SOD、MDA、MPO检测试剂盒购于南京建成生物研究所；ICAM-1、NF-kB p65一抗均购自美国Santa Cruz公司；SP试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。? 　　1．2 方法 参照Cooper等[5]的方法建立小鼠溃疡性结肠炎模型:将DSS溶于蒸馏水，配成4%DSS溶液，让BALB/c小鼠自由饮用7 d。实验设正常对照组、模型组、SASP组(520 mg/kg)、和ACAM组(50、100、200 mg/kg)。正常对照组小鼠饮用蒸饮水，造模组自由饮用蒸饮水配制的4%DSS溶液；同时灌胃给予干预药物或溶剂对照(0．2 ml/10 g，1次/d×7 d)。其间，每天称量体质量，采用联苯胺法检测大便稳血，观察粪便性状；以体质量下降百分比、隐血试验及大便性状评分之和除以3作为DAI[3](见表1)。第8天处死小鼠，取下整段结肠，用冰冷生理盐水冲洗干净。结肠组织分两部分:一部分快速放入氮中速冻，转入-70℃低湿冰箱保存，用于检测SOD、MDA、MPO，检测操作按相应试剂盒说明进行；另取远端结肠约1 cm的组织块放入4%甲醛溶液中固定、切片、HE染色，检测ICAM-1、NF-κB p65表达。免疫组化检测步骤严格按相应试剂盒说明进行，均以非免疫性山羊血清封闭非特异性抗原，一抗分别为1:200的ICAM-1与NF-κB p65；二抗均为生物素化头号抗免IgG 工作液，以PBS缓冲液代替一抗做阴性对照；ICAM-1以细胞膜呈橙黄色为阳性，NF-kBp 65以胞膜或胞核呈橙黄色为阳性。每张切片选取10个X400视野，采用GD-8型病理影像多媒体分析系统，测定面积积分光密度作为ICAM-1、NF-κB p65表达含量。? 　　 　　1．3 统计学方法 所有用SPSS12．0统计软件处理，计量资料数据用（x±s）表示，采用单因素方差分析和非参数Wilcox on秩和检验，比较各组资料间的差异，以P[4]认为，DSS通过对结肠上皮细胞的直接毒性作用以及激活炎性细胞，释放炎性介质和细胞因子，后者诱发非特异性免疫反应，导致结肠黏膜损伤。临床检验证实，中性粒细胞活化、浸润是UC活动期的突出特点；MPO是存在于中性粒细胞，被认作是量化炎性反应的一项重要指标[5]。中性粒细胞呼吸暴发，产生大量氧自由基，诱发脂质过氧化，引起蛋白质变性和交联，细胞膜结构受损。SOD是存在于生物体内的重要的抗氧化酶系，能有效地清除氧自由基，从而抑制肠组织中的脂质过氧化损伤；MDA为脂质过氧化的终末产物，其含量反映了组织中过氧化损伤程度。本实验显示，SASP和ACAM能明显抑制DSS诱导小鼠结肠组织MPO活性和MDA含量升高，阻遏SOD活性下降，提示ACAM可能抑制中性粒细胞浸润，减轻机体抗氧系统破坏，促进氧自由基的清除。中性粒细胞和其他炎性细胞释放大量炎症介质(白细胞三烯、前列腺素等)[4]用DSS诱导严生必威体育精装版合免疫缺陷小鼠(缺乏T和B淋巴细胞)，同样能诱导出严重的结肠炎性反应，