雷公藤内酯醇抑制佐剂性关节炎组织ＮＯ生成的实验研究 雷公藤多苷片.docx

PAGE PAGE 1 雷公藤内酯醇抑制佐剂性关节炎组织ＮＯ生成的实验研究 雷公藤多苷片 　　 　　摘要 目的：探讨雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠病变关节组织iNOS表达和NO含量的影响。方法：在建立大鼠佐剂性关节炎模型基础上，给予不同剂量雷公藤内酯醇后，检测关节肿胀度和病变关节组织NO含量，观察病变关节组织病理损害程度和iNOS免疫组织染色结果。结果：与模型组比较，3个雷公藤内酯醇治疗组关节肿胀度和病变关节组织NO含量明显减少，病变关节组织的病理损害明显改善，iNOS免疫阳性细胞积分光密度显著减少。结论：雷公藤内酯醇可抑制佐剂性关节炎大鼠病变关节组织iNOS表达从而减少病变关节组织NO含量。 　　关键词 雷公藤内酯醇 佐剂性关节炎 一氧化氮 一氧化氮合酶 实验研究 　　 　　一氧化氮(NO)是重要的细胞因子，研究表明，NO参与了炎症反应和免疫损伤过程，在炎症过程中，单核细胞、巨噬细胞产生NO，加重炎症反应程度。有实验证据表明[1]，NO在类风湿性关节炎的发生发展中起重要作用，抑制和减少炎细胞产生NO，可明显减轻炎症病变程度。体外实验表明[2]雷公藤醋酸乙酯提取物可抑制类风湿性关节炎病人关节软骨细胞产生高浓度NO的病理损害程度。 　　而作为雷公藤的主要有效成分之一的雷公藤内酯醇，其治疗类风湿性关节炎的机理之一是否与其在体内影响病变关节滑膜组织细胞NO的产生过程有关?国内外尚未见文献报道。本研究旨在建立大鼠佐剂性关节炎模型基础上，通过应用不同剂量的雷公藤内酯醇，观察其对佐剂性关节炎病变组织细胞iNOS表达和NO水平变化的影响，探讨雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎有关的作用机理。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1 药品和试剂：雷公藤内酯醇(纯度为99．95％，批号购于福建省医学科学研究所，溶于2％丙二醇，并用200目滤器过滤除菌后备用。福氏完全佐剂(FCA)购于上海华美生物工程有限公司。一氧化氮(NO)检测试剂盒购于南京聚力生物医学工程研究所。兔抗大鼠一氧化氮合酶(NOs)多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、即用型碱性磷酸酶（SABC）试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。RY-2000瑞医病理图文分析系统(东南大学瑞医科技产品)。 　　1．2 动物分组：SD大鼠50只，由浙江大学医学院实验动物中心提供，雌雄不限，体重200~250g，自由饮食，适应性喂养7d后随机分成5组：①空白对照组(A组)；②佐剂性关节炎模型组(B组)；③低剂量(0．1mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(C组)；④中剂量(0．2mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(D组)；⑤高剂量(0．4mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(E组)。每组10只。 　　1．3 佐剂性关节炎模型的建立：福氏完全佐剂(FCA)制备，将液体石蜡和羊毛脂(2∶1)共热至70℃高压灭菌后，按每毫升加入卡介苗10mg制成。佐剂性关节炎诱发：用微量注射器于右后足跖皮内注射FCA0．1ml，约14d左右可诱发成功佐剂性关节炎模型，正常对照组注射等量生理盐水。 　　1．4 实验过程和方法：各组动物处理：佐剂性关节炎诱发的第15d，A组及B组动物右后足关节上方组织内肌肉注射等容积的2％丙二醇溶液，每天1次，连续5d；C组、D组和E组动物给予雷公藤内酯醇治疗，剂量分别为0．1mg/kg、0．2mg／kg和0．4mg／kg，于病变关节上方肢体肌肉内注射，每天1次，连续5d，于实验的第21d所有大鼠行心脏穿刺取血后处死。提取实验关节组织，然后进行一氧化氮(NO)检测和一氧化氮合酶(iNOs)免疫组织化学染色观察。 　　1．5 观察指标：分述如下。 　　1．5．1 足跖肿胀度：用容积测定仪测定右后跖排水量，以致炎前后排水量(ml)差值代表右后跖的肿胀度。 　　1．5．2 组织学观察：实验结束处死动物后，提取各组动物右后踝关节组织标本，福尔马林液固定，脱钙，常规制片，H.E染色镜检。 　　1．5．3 一氧化氮(NO)检测：提取各组动物右后踝关节组织标本，用生理盐水制成10％(w／v)组织溶浆，5000转／分离心15min，取上清液按照试剂盒说明书操作检测关节组织NO水平。 　　1．5．4 一氧化氮合酶(iNOs)免疫组织化学染色观察：取实验关节组织石蜡包埋块切片，用SABC法免疫组化染色，主要步骤为：常规脱蜡至水，滴加3％H?2O?2，室温放置5min；滴加10％正常羊血清，室温放置10min，勿洗；滴加兔抗大鼠NOs多克隆抗体(1∶250)，4℃、24h；滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶200)37℃，1h；滴加SABC，37℃，1h；随后进行DAB-H?2O?2显色5~8min；阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同。每步之间用0．1mol／L PB