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第九章 核酸的生物合成;中心法则;;第一节 DNA的生物合成;2. DNA生物合成的基本问题;; 酶; 冈崎片段与半不连续复制(okazaki 1968年); 复制方向:单起点、双向或单向复制
引物(primer)及引物酶(primase)
引物的切除与连接
5’-3’外切酶 切除引物 (DNA聚合酶Ⅰ )
DNA连接酶 (大肠杆菌DNA连接酶/T4连接酶)
复制的起始
辨识起点(富含AT区) 解旋(拓扑异构酶)
解链 单链结合蛋白(SSB) ;;三、真核DNA的复制合成;;DNA复制过程;真核生物DNA复制叉结构示意图;四、反转录作用(RNA指导下的DNA合成);五、 DNA的损伤与修复;当DNA受到大剂量紫外线(波长260nm附近)照射时,可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合,形成二聚体,例如TT二聚体。
;2. DNA损伤修复;光复活(photoreactivation);切除修复(excision repair);重组修复(recombination repair);SOS修复;3. 基因重组与DNA克隆(基因工程);一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有400~500多种。;运载体种类:质粒、噬菌体和动植物病毒。; DNA重组与克隆;PCR(polymerase Chain reaction);;PCR的引物设计
PCR扩增产物的特异性主要由引物决定,引物的设计是PCR成功的关键,
? 引物位置和产物长度
根据不同目的和要求确定,长度一般在200~800bp之间
? 引物的长度
一般为18~25bp
? 末端核苷酸
3’端不得有任何修饰
? G+C含量和Tm值
一般在40-60%之间,两条相差2-3 ℃;第二节 RNA的生物合成;反应体系:DNA模板,NTP,酶,Mg2+,Mn2+,合成方向 5→3。连接方式-- 3 , 5磷酸二酯键。
转录特点:不对称转录--DNA片段转录时,双链DNA中只有一条链作为转录的模板,这种转录方式称作不对称转录。
模板链(template strand)及反意义链(antisense strand):指导RNA合成的DNA链为模板链,又称反意义链。编码链(coding strand)及有意义链(sense strand):不作为转录的另一条DNA链为编码链,又称有意义链。由于基因分布于不同的DNA单链中,即某条DNA单链对某个基因是模板链,而对另一个基因则是编码链。
原料:四种磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中???为U
合成过程:连续,
方向:5‘→3’从头合成,5′—末端的起始核苷酸常为GTP或ATP;;;不对称转录
“转录单位”(transcription unit)
以操纵子(operon)为转录的功能单位,结构上包括四个功能区:多顺反子(结构基因区)、启动子、操作子、终止子和调节基因。
原核RNA聚合酶
转录过程
;调节基因; 大肠杆菌的RNA聚合酶
全酶由5种亚基α2ββ’?σ 组成,σ因子与其它部分的结合不是十分紧密,它易于与β’βα2分离,没有σ、 ?亚基的酶称为核心酶——只催化链的延长,对起始无作用。
五种亚基的功能分别为:
α亚基:与启动子结合功能。
β亚基:含催化部位,起催化作用,催化形 成磷酸二酯键。
?亚基:在全酶中存在,功能不清楚。
β’亚基:与DNA模板结合功能。
σ亚基:识别起始位点。
;识别
解链
起始
延伸
终止; 1. 起始位点的识别
σ识别正确的启动位点,启动子的结构至少由三部分组成:-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号;-10序列是酶的紧密结合位点(富含AT碱基,利于双链打开);第三部分是RNA合成的起始点。
;-35;4. 转录终止
转录终止信号有两种情况
弱终止子:依赖ρ因子(终止因子,terminators)的终止
NusA蛋白识别DNA链上的终止信号,在ρ因子帮助终止。
强终止子:( 1 )在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。(2)富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列,它们转录的RNA链的末端为一连串U(连续6个)。;三、真核生物的转录作用;四、转录过程的选择性抑制剂 ;五、转录产物的“加工”(成熟过程);rRNA前体的加工
?rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。
????加工过程:
?1、剪切作用:需核酸酶参与。??? 2、甲基化修饰
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