生物化学实验指导课件.pptx

生物化学实验指导课件;前言; 实验一 蛋白质的沉淀、变性反应 实验二 蛋白质的等电点测定(pH法) 实验三 酶的特性 实验四 菜花(花椰菜)中核酸的分离 和鉴定 ; 实验一 3，5—二硝基水杨酸比色定糖法 实验二 Fo1in—酚法测定血清蛋白质含量 实验三 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 实验四 蛋白质分子量测定（葡聚糖凝胶薄 层层析法） 实验五 脂肪酸的β-氧化 实验六 核酸浓度测定—定磷法 实验七 血液中转氨酶活力的测定(分光光 度法) 实验八 维生素C的定量测定 ; 实验一 酯酶的分离、纯化与活性测定 实验二 酯酶同功酶的垂直板不连续聚 丙烯酰胺凝胶电泳分析 实验三 底物浓度对酶促反应速度的影 响（米氏常数的测定） ;注意事项 ; 酯酶是A—酯酶，B—酯酶和胆碱酯酶的总称，它与人体有机磷药物中毒机制有关。 本实验利用离子交换层析法分离和纯化酯酶，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM—纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE—纤维素). 蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度(或二者同时改变)来实现；与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验采用CM—纤维素离子交换剂，通过柱层析，经梯度洗脱从鼠肾丙酮粉抽提液中分离、纯化酯酶。 梯度洗脱法是在洗脱过程中，使洗脱液的pH或盐浓度(或两者同时)发生连续的梯度变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下洗脱下来。本实验采用的是盐离子浓度梯度洗脱法，其装置由两个彼此相连的容器组成，在与层析柱相连接的一个容器(混合瓶)中，放入梯度洗脱开始时所需浓度的盐溶液(低浓度)，并配有搅拌装置，另一容器(贮液瓶)中放入高浓度的盐溶液，其浓度即梯度洗脱最后所需的浓度。两个容器的底部必须保持水平，液面的高度也应该相同。这样，当两容器之间的通道打开，并使混合瓶溶液流进层析柱时，梯度即开始形成。由于这两个容器是连通的，当混合瓶的溶液开始流入层析柱，它的液面高度就逐渐下降，为了维持两容器的液面高度的一致，高浓度的盐溶液即从导管流入混合瓶，结果混合瓶中溶液的盐浓度呈梯度上升。;;操作;一、粗酶制剂的制备 ;二、CM—纤维素离子交换剂的处理 ;三、层析柱的安装和平衡 ;返 回;四、加样和梯度洗脱 ;五、酯酶活性的测定 ;六、结果处理 ;蛋白含量、酶活性和梯度洗脱液浓度曲线 ;粗酶制剂和层析洗脱液酯酶比活性的比较 ;试剂与器材 ;返 回;返 回;返 回;返 回;注意事项 ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel electrophoresis简称PAGE）根据其有无浓缩效应，分为连续与不连续系统2大类，前者电泳体系中缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。目前常用的多为垂直的圆盘及板状两种。前者凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状，因而称为圆盘电泳（disc electrophoresis）,其装置如图8—7；后者，凝胶是在间隔几毫米的平行玻璃板中聚合，故称为板状电泳（slab electrophoresis）,其装置图见第二部分实验18。两者电泳原理完全相同。现以R.J.Davis等（1964）用高PH不连续圆盘PAGE分离血清蛋白为例，阐明各种效应的原理。不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶组成，它们在直立的玻璃管中（或2层玻璃板中）排例顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶，如示意图8—8。样品胶是核黄素催化聚合而成的大孔胶，T=3%，C=2%，其中含有一定的样品及pH6.7 的Tris-HCI,凝胶缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲液稀释。目前一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%蔗糖，同样有防止对流及样品被稀释的作用。实际上，浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及PH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘