基因工程第二章1Jun.pptx

第二章 基因工程中常用的工具酶;基因工程的基本流程;TOOLS FOR GENE CLONING SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS ;第二章??基因工程中常用的工具酶;一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途 ;一、限制性内切酶的发现和细菌的限制—修饰作用;E. coli-λ噬菌体的限制修饰模式 ;1959年，瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNA;细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰， ① Dam甲基化酶 -- 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 -- 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。;细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。;Werner Arber于1962-1968年发现限制与修饰体系，1968年分离得到I型限制酶 EcoB.;到1986 年下半年，发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶。 到 2006 年2 月，共发现 4583 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3773 种，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有 68 、3692 、10 种。;一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途 ;限制性内切酶系统中有两个部分组成： 1.核酸酶 2.甲基化酶 ?来源：细菌染色体、噬菌体/病毒 ?限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随DNA的连接、转导或转染而传给其他个体; 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。;限制酶裂解DNA双链的磷酸二酯键 酶切得到5`-P和3`-OH;一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途 ;三、限制性核酸内切酶的命名;一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途 ;;一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途 ;五、II型限制性核酸内切酶的基本特性;?根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类： A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。有以下4种情况： a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列； b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。 c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC) d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC);B. IIS型酶 ? 另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。;C.第三种II型限制性内切酶 ? 第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。 这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。