SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量.ppt

SDS测定蛋白质 相对分子质量 【目的要求】 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2、掌握SDS测定蛋白质相对分子质量的原理。 【实验原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带静电荷多少等因素所造成的电泳迁移率间的差别。 【实验原理】 SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS结合比为1.4 g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。 【实验原理】 SDS与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。 【实验原理】 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 按所制成的凝胶形状又有垂直板型电泳和垂直柱型电泳。本实验采用SDS-不连续系统垂直板型凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量。 当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系： lgMr = K - bm 将已知相对分子质量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对Mr的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 【实验原理】 【实验步骤】 一、安装垂直板型电泳装置 一、安装垂直板型电泳装置 将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。 分离胶的配制 10%(ml) H2O 10 30%丙烯酰胺 10 分离胶缓冲液(pH8.8) 7.5 10% SDS 0.3 TEMED 0.03 10%过硫酸铵 0.1 总体积 30ml 二、凝胶的制备 1、分离胶的制备 将所配制的凝胶溶液沿着凝胶的长玻璃片的内面用细长头的滴管加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约2 cm。用滴管沿玻璃片内壁加一层蒸馏水（用于隔绝空气，使胶面平整），约30-60 min凝胶完全聚合，用滴管吸去分离胶胶面的水封层，并用无毛边的滤纸片吸去残留的水液。 浓缩胶的配制 4%(ml) H2O 3.05 30%丙烯酰胺 0.65 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 1.25 10% SDS 0.05 TEMED 0.03 10%过硫酸铵 0.05 总体积 5ml 2、浓缩胶的制备 按表配制浓缩胶，混匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃片上缘1 cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子” 的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约30 min后凝胶聚合，再放置30 min。小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。 二、凝胶的制备 1、标准蛋白质样品的处理 称标准蛋白质样品各1 mg左右，分别转至带塞的小试管中，按1.0-1.5 g/L溶液比例，向样品加入“样品溶解液”，溶解后轻轻盖上盖子（不要盖紧，以免加热时迸出），在100 ℃沸水浴中保温5分钟，取出冷至室温。 三、蛋白质样品的处理 2、待测蛋白质样品的处理 固体样品的处理和标准蛋白质相同。如待测样品已在溶液