琼脂糖凝胶电泳的操作步骤.pdf

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备 1%琼脂糖凝胶 (大胶用 70ml, 小胶用 50ml): 称取 0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于 锥形瓶中 ,加入 70 ml(50ml)1 ×TAE, 瓶口倒扣小烧杯 .微波炉加热煮沸 3 次至琼脂 糖全部融化 ,摇匀 ,即成 1.0% 琼脂糖凝胶液 . 2. 胶板制备 :取电泳槽内的有机玻璃内槽 (制胶槽 )洗干净 ,晾干 ,放入制胶玻璃板 . 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好 ,形成模子 .将内槽置于水平位置 ,并在 固定位置放好梳子 .将冷却到 65 ℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上 ,使胶液缓慢展开 ,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层 .室温下静置直至凝 胶完全凝固 ,垂直轻拔梳子 ,取下胶带 ,将凝胶及内槽放入电泳槽中 .添加 1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止 . 3. 加样 :在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液 ,上样缓冲液的最终 稀释倍数应不小于 1X.用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内 , 每加完一个样品 ,应更换一个加样头 , 以防污染 ,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶 面 .(注意 :加样前要先记下加样的顺序 ). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳 ,电压 60-100V, 样品由负极 (黑色) 向 正极 (红色 )方向移动 .电压升高 ,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 .当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约 1cm 处时 ,停止电泳 . (5) 电泳完毕后 ,取出凝胶 ,用含有 0.5 ug/ml 的溴化乙锭 1×TAE 溶液染色约 20 min, 再用清水漂洗 10 min. (6)观察照相 :在紫外灯下观察 ,DNA 存在则显示出红色荧光条带 ,采用凝胶成像系 统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒 DNA 由于构形不同， 在加溴化乙锭的琼 脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质 粒 DNA （cccDNA ）、线性质粒 DNA （L-DNA ）和开环质粒 DNA （ocDNA ）。 实验材料和 试剂 （一）实验样品 质粒 pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII 分子量标准 2 ．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml 溴化乙锭溶液 4 ．电泳缓冲液（ TAE ） 40 mmol/L Tris- 乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法： 24.2 克 Tris 碱，5.71ml 冰乙酸， 10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) ， 定容至 5000ml ） 5 ．0.7% 琼脂糖凝胶 （配制方法：称取琼脂糖 0.35 克，加入 50ml TAE 电泳缓冲液） （三）仪器 微量移液器 电泳仪 水平电泳槽 透射紫外观察仪 实验步骤 1．选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负 极的线路。 2 ．选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底 部离电泳胶模底部的距离为 1.0mm 。 3．制备 0.7% 琼脂糖凝胶， 100 ℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。 4 ．用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝 胶板时发生渗透。 待琼脂糖凝胶冷却至 60 ℃左右时， 加入一滴溴化乙锭，摇匀， 轻轻倒入电泳胶