ELISA实验操作中常见问题分析.pdf

由于 ELISA( 酶联免疫试验 )具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝 炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是 ELISA 实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我 们必须对影响 ELISA 实验结果各因素有一定的认识。 优质的 试剂 ，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象 （就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的 OD 值却明显偏高）是各个厂家洗板 机调试中经常遇到的问题。现将 ELISA 实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善 洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。 1 标本及采集、贮运因素 严重溶血 ，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物 显色造成假阳性； 混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有 细菌污染 ，菌体中可 能含有内源性 HRP ，也会产生假阳性反应； 标本凝固不全 ，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未 开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在 ELISA 测定过程中可以形成肉眼可 见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果； 采血试管洗涤不彻底 、反复使用易交叉污染； 塑料试管能吸附抗 原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。 血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于 4 ℃，标 本在冰箱中保存时间过长导致血清 IgG 聚合，使间接法的 试剂 本底加深。超过一周测定的需－ 20 ℃保存。 冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应 先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使 抗体 效价跌落，所以测 抗体 的血清标本如需保存作多次 检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会 增加 OD 值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关； EDTA 、酶抑制剂（如 NaN3 ）可抑制 ELISA 系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或 标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 2 、试剂的影响 ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。 由于历史的原因， 人们往往以反应本底的好坏 来衡量 ELISA 反应 试剂 盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包 被，该类 试剂 盒的流行病学敏感度不够， 稳定性也成问题。也有厂家坚持 试剂 盒高的流行病学敏感度， 科学地对待反应结果。 基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性， 就 HCV-ELISA 试剂 盒来讲， 第 一代产品为合成肽抗原，主要是 HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程 抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了 HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用 了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的 HCV 特异性抗原。第三代 试剂 的敏感 度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下： 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵母 菌为表达 系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点： a. 分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利 用基因工程制备的抗原，分子量更大。 b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使