基因工程的原理和技术.ppt

①目的基因的获取； ②表达载体的构建； ③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。 单独的目的基因（DNA片段）是不能稳定遗传的。 为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传 给下一代，同时使目的基因能正常表达和发挥作用， 必须构建表达载体。 温故知新 为什么要有这一步 基因工程操作步骤的必要性 第二步：基因表达载体的构建 —— 基因工程的核心 构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以以传给下一代。 基因表达载体的组成： 目的基因、启动子、终止子、标记基因等 基因表达载体 启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需蛋白质。 终止子：位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含目的基因，从而筛选出来。 如：抗生素抗性基因 目的基因 标记基因 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同种 一个切口 两个黏性末端 为什么不能将目的基因直接导入受体细胞？ 通过cDNA文库获得的目的基因有启动子和终止子吗？ 在构建表达载体（重组DNA分子）过程中需要什么分子工具？ 只考虑两两结合，可产生几种重组DNA分子？ 三种 不能稳定存在并表达。 cDNA文库的目的基因中没有启动子和终止子. ①目的基因的获取； ②表达载体的构建； ③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。 含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 温故知新 为什么要有这一步 基因工程操作步骤的必要性 第三步：将目的基因导入受体细胞 转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞中维持稳定和表达的过程，称为转化 常用的受体细胞： 动植物细胞和大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等微生物。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 ——转化 农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染 双子叶植物和裸子植物，受植物体伤口处的细胞分泌的大量酚类化合物的吸引，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 1）将目的基因导入植物细胞 a.农杆菌转化法（采用最多的方法） 原理：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞染色体的DNA上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。 优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得。 我国科学家独创的一种方法 实例：我国的转基因抗虫棉 （1）常用于单子叶植物 的基因转化 （2）缺点：成本较高 基因枪法 花粉管通道法 2）将目的基因导入动物细胞 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 经胚胎早期培养后 移植到雌性体内 受体细胞： 显微注射技术 基本操作程序： 原因是：受精卵全能性较高，可使外源基因在相应的组织细胞内表达。 受精卵 最常用的方法: 1）早期基因工程为什么选用原核生物作为受体细胞？ 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 2）应用最为广泛的受体细胞是大肠杆菌 3）方法： 3）将目的基因导入微生物细胞 a.用Ca2+处理细胞（以增加细菌细胞壁的通透性），使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞； b.是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 思考4:利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗? 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的. 1.将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 2.将目的基因导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） 3.将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理 花粉管通道法 小结 基因工程操作步骤的必要性 ①目的基因的获取； ②表达载体的构建； ③将目的基因导入受体细胞； ④目的基因的检测与鉴定。 因为并不是所有受体细胞的DNA都接纳了目的基因、也并不是所有插入的目的基因都能正确表达，因此需要 筛选。只有通过检测和鉴定，才能得知目的基因是否 能够在受体细胞中稳定存在和正确表达。 温故知新 为什么要有这一步 第四步：目的基因的检测和鉴定 ①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 ——DNA分子杂交 DNA分子杂交技术 【小组交流】阅读教材14页，讨论什么是DNA分子探针？ 检测时探针通过什么原理来检测目的基因？ 探