整理后实验六酵母蔗糖酶粗提及其比活力测定.ppt

整理后实验六酵母蔗糖酶粗提及其比活力测定;蔗糖酶活性及比活性测定原理; 蔗糖酶的酶活单位：在40℃水浴反应10min，测定吸光值A540，增加个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。 蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶的纯度越高。;试剂 （一） 蔗糖酶的粗提及活性测定 （1）冰冻无水乙醇：1瓶/班 （2）0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer，2000ml （全班共用） （3）蔗糖, 用0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer配制，200ml （大组共用） （4）2 mol/L NaOH， 1000ml （全班共用） （5）3,5-二硝基水扬酸(DNS)试剂：可配300ml （全班共用） 克酒石酸钾钠溶于50ml水中（电炉加热溶解，不用沸腾），把克3,5-二硝基水杨酸(DNS)和26.2ml2 mol/L NaOH 加到酒石酸钾钠的热溶液中，电炉加热溶解，冷却到50-60℃，再加克苯酚和克亚硫酸钠．搅拌使溶解．冷却后加水定容至100ml，过滤，贮于棕色瓶中。 ;实验方法 （一）粗提取酵母蔗糖酶 （1） 量取2g的面包酵母，加液氮研磨（加入少量石英砂）充分研磨，再加入18ml的（），搅拌混合,再加入液氮研磨, （2）待溶液完全解冻后,转入离心管,2ml PBS洗研钵,转入离心管.;（二）热提取酵母蔗糖酶 （3） 11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量略）。 （4） 将上述上清液置于45℃的恒温水浴锅中，用玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min条件下离心10min，离心后取上清液，按下表方法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。;（三）乙醇提取酵母蔗糖酶 （1）取上述第4步中的上清液10ml，缓慢加入10ml的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为50％），并搅拌5min，此过程在冰浴中进行。然后装入离心管中，转速3000r/min条件下离心5min，离心后弃上清液，留沉淀，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇残液。 （2）将沉淀用15ml的的PBS（）搅拌溶解30min，溶液如为浑浊液，10000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表方法测蔗糖酶C的活性及蛋白含量。;表1 酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定