大规模培养细胞技术.doc

可修改 欢迎下载 精品 Word 可修改 欢迎下载 精品 Word 可修改 欢迎下载 精品 Word 大规模培养细胞技术 摘要： 细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。 关键词：细胞培养；贴壁；悬浮；固定化 前言 动物细胞培养开始于本世纪初1962年，动物细胞培养规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，动物细胞培养已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。本文对细胞的培养工艺做一综述。 1.细胞培养的定义 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。 在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。 2.动物细胞培养的工艺 2.1贴壁培养法 贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行单层培养。贴壁依赖性细胞在培养时要贴附于培养容器的壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。 贴壁培养系统主要有滚瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等，其中尤以滚瓶培养和微载体生物反应器培养更为多见。 2.1.1滚瓶培养系统 培养贴壁依赖性细胞最初采用滚瓶系统培养。滚瓶培养的优势在于能增加供细胞贴壁的表面积，同时温和的滚动有利于细胞生长。细胞接种在滚动的圆筒形滚瓶中，培养过程中滚瓶不断滚动，在培养瓶滚动时，细胞有一段时间离开培养基，使细胞交替接触培养液和空气，增加了气体的交换，有利于细胞生长。滚瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需要简单的增加滚瓶数量等优点。但滚瓶培养也有其缺点，劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。 2.1.2微载体培养系统 微载体培养技术于1967年被用于动物细胞大规模培养[1]。经过30余年的发展，该技术目前已日趋完善和成熟，并广泛应用于生产病毒疫苗和重要蛋白质产品等。 微载体培养原理是将对细胞无害的微载体颗粒加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，但动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，所以无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停，数小时后，待细胞附着于微载体表面后，维持低转速（最大速度75r/min），进入培养阶段。 我国从20世纪80年代后期开始了细胞培养专用介质的研究工作，成功地开发了CT-1、CT-2和CT-3等适合于不同细胞系培养的微载体[2,3]。 微载体法培养动物细胞有很多好处[1]：①可在反应器中提供大的比表面积；②兼有悬浮培养和贴壁培养的优点；③可采用均匀悬浮培养；④可用普通显微镜观察细胞在微载体上的生长情况；⑤放大容易；⑥适用于多种贴壁依赖性细胞培养；⑦细胞收获容易；⑧劳动强度小，占地面积小。微载体系统也有它的缺陷：①细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤；②微载体价格比较贵；③需要较高的接种细胞量。近年来，已经开发了许多新的多孔性微载体和新的反应器系统，以弥补微载体系统的不足。张孝兵等[4,5]以明胶为原料，用悬浮成球、甲苯制孔的方法制备了大孔明胶微载体。 目